現(xiàn)代分子診斷技術(shù)

現(xiàn)代分子診斷技術(shù)第1頁/共52頁傳統(tǒng)的診斷程序先要對病原物質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后再分析它的生理學(xué)特性；確定它到底是哪一類的病原物，是病毒、細(xì)菌，還是其他物質(zhì)。實(shí)踐證明:比較有效,檢測到病原微生物相對比較特異；診斷成本高、速度慢、效率低。如砂眼衣原體、朊病毒第2頁/共52頁現(xiàn)代分子診斷技術(shù)主要是指應(yīng)用免疫學(xué)和分子生物學(xué)的方法對病原物質(zhì)進(jìn)行診斷檢測。一種有效的診斷方法應(yīng)具備：1、專一性（specificity）強(qiáng)，診斷只對某一種病原菌分子產(chǎn)生陽性反應(yīng)；2、靈敏度(sensitivity)高；3、操作簡單(simplicity).第3頁/共52頁前景:2000年,DNA診斷試劑全球銷售額達(dá)到6億美元;2004年,銷售額將達(dá)到20億美元;分子診斷的其他部門銷售額以每年5％－10％的速度增長;

現(xiàn)代分子診斷試劑的生產(chǎn)和銷售已成為現(xiàn)代生物技術(shù)中利潤很高的一項(xiàng)行業(yè).第4頁/共52頁第一節(jié)酶聯(lián)免疫吸附測定抗體高度特異地與抗原分子結(jié)合通過抗原-抗體的特異識別反應(yīng)進(jìn)行檢測酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbantassay,ELISA)第5頁/共52頁酶聯(lián)免疫吸附測定的原理工作原理：主要是利用了一抗與目標(biāo)分子的特異性結(jié)合。假定目標(biāo)分子是一種蛋白質(zhì)，那么要得到可用于檢測的抗體，則首先需要純化出這種蛋白質(zhì)，然后用純化的蛋白質(zhì)免疫動物（一般是兔子），在免疫過程中兔子的血清就會產(chǎn)生多克隆抗體。第6頁/共52頁檢測過程：①將待測樣品結(jié)合在固相支持物（如96孔的微量滴定板）上；②加入可以與目標(biāo)分子特異反應(yīng)的抗體，即一抗（primaryantibody）,反應(yīng)后沖洗，將未結(jié)合上的一抗洗去；③加入二抗（secondaryantibody）。二抗通常只特異的識別一抗，而不識別目標(biāo)分子（二抗上還連著一種酶，如堿性磷酸酶、過氧化物酶或脲酶等，這些酶都能夠催化一種化學(xué)反應(yīng)將無色底物轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)），一抗與二抗反應(yīng)完成后，再次沖洗將未與一抗結(jié)合的二抗洗去。④加入無色底物。第7頁/共52頁ELISA程序和結(jié)果第8頁/共52頁使用多克隆抗體的缺點(diǎn)①同一抗體混合物中不同抗體的含量會有差異，而且每次制備的抗體的量之間也會有差異。②無法區(qū)別相類似的目標(biāo)分子：如果病原分子與非病原分子之間只相差一個抗原決定簇，這時多克隆抗體就無法區(qū)分，因?yàn)樵贓LISA檢測中都會發(fā)生顏色變化。單克隆抗體特異性強(qiáng)

只結(jié)合抗原上某一單一位置第9頁/共52頁酶聯(lián)免疫吸附測定的局限性僅憑ELISA結(jié)果容易造成誤診，ELISA檢測只能作為一種初步的檢測手段，要進(jìn)一步確診還必須進(jìn)行western檢測。要提高ELISA檢測的準(zhǔn)確度,就必須提高一抗的特異性。在使用抗體時，要求其抗原的編碼其目標(biāo)識別位點(diǎn)的基因要表達(dá)，而且目標(biāo)位點(diǎn)不能夠以任何方式被覆蓋或阻斷，否則都將影響抗體與抗原的結(jié)合。第10頁/共52頁第二節(jié)DNA診斷系統(tǒng)DNA診斷的理論基礎(chǔ)：任何一個決定生物學(xué)特性的DNA序列都應(yīng)該是獨(dú)特的，都可以作為專一性的診斷標(biāo)記。第11頁/共52頁一、核酸雜交工作原理：

◆兩條DNA鏈之間可以通過堿基配對而形成氫鍵。3個關(guān)鍵要素：

★探針DNA

★目的DNA

★

信號檢測第12頁/共52頁步驟：①將單鏈目的DNA結(jié)合于膜上；②加入單鏈、標(biāo)記過的探針DNA，在一定溫度和離子濃度下使探針分子與目標(biāo)DNA分子堿基配對；③沖洗，洗去多余的未結(jié)合的標(biāo)記探針DNA；④檢測探針和目標(biāo)DNA形成的雜合分子。第13頁/共52頁雜交探針必須是高度特異性的DNA片段種級探針：區(qū)分兩個或多個物種亞種級探針：區(qū)分物種內(nèi)特定的株系DNARNA化學(xué)合成或克隆的完整基因基因的一個片段第14頁/共52頁分離雜交探針的方法：提取某一病原微生物株系的染色體DNA；限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶解；得到的酶解片段克隆進(jìn)一質(zhì)粒載體，構(gòu)建質(zhì)粒文庫；文庫中重組質(zhì)粒的插入片段即可用來分別同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA進(jìn)行雜交、篩選。第15頁/共52頁核酸雜交的靈敏度和可靠性極高；用探針直接同糞便樣品、尿樣、血樣、喉洗液和組織樣品中的目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交，且無需預(yù)先純化DNA；若樣品中的目標(biāo)分子非常少，則需通過PCR將目的序列擴(kuò)增，再進(jìn)行雜交檢測。

從理論上講，用DNA雜交來診斷疾病可用于對所有的致病微生物的檢測。第16頁/共52頁非同位素標(biāo)記探針32P的缺點(diǎn)：半衰期短，僅13天；操作起來比較危險(xiǎn)；必須要有特殊的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備進(jìn)行操作；放射性垃圾的處理繁瑣。第17頁/共52頁非放射性雜交檢測系統(tǒng)：通過酶促反應(yīng)將某種底物轉(zhuǎn)變成生色物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)而達(dá)到放大信號的目的。采用將生物素（biotin）標(biāo)記的核苷酸摻入DNA的方法制備探針。生物素標(biāo)記的DNA在室溫下至少可保存一年。檢測發(fā)光和顏色變化可在幾小時內(nèi)完成。第18頁/共52頁BBBBAPBBAP生物素加入鏈霉素抗生物蛋白加入生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶探針目的DNA加入不同的生色或化學(xué)發(fā)光底物第19頁/共52頁熒光標(biāo)記的引物直接進(jìn)行PCR檢測DNA引物1引物2熒光染料PCR層析熒光檢測游離引物第20頁/共52頁分子夾心探針檢測發(fā)出熒光分子夾心探針(沒有熒光)熒光團(tuán)猝滅劑目的DNA與目的DNA雜交第21頁/共52頁瘧疾的分子診斷：檢測是否存在瘧原蟲抽取血樣進(jìn)行鏡檢免疫診斷:ELISA檢測瘧原蟲蛋白或抗體

無法區(qū)分是以前感染還是現(xiàn)在感染DNA雜交診斷第22頁/共52頁DNA的雜交探針是一段瘧原蟲的高度重復(fù)的DNA序列。具體的分離過程：構(gòu)建一個瘧原蟲的核基因文庫;用標(biāo)記的瘧原蟲核DNA作探針去篩選核基因文庫;選出那些雜交信號最強(qiáng)的克隆;用這些選出來的片段作探針，與瘧原蟲及其同屬中不導(dǎo)致瘧疾的種的核基因作雜交，以檢查該片段作為DNA探針的可靠性。第23頁/共52頁錐蟲的檢測

錐蟲在人體中可侵入肝、脾、淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其中大量繁殖并殺死寄主細(xì)胞。顯微鏡檢新鮮血液取新鮮血液感染未攜帶錐蟲的寄生蟲,30-40天后殺死昆蟲,鏡檢昆蟲的腸道免疫檢測:假陽性高第24頁/共52頁P(yáng)CR檢測針對錐蟲特有的一段188bp的DNA序列設(shè)計(jì)引物，特異地從錐蟲基因組中擴(kuò)增得到188bp的條帶。第25頁/共52頁細(xì)菌性傳染病及病毒性疾病的分子診斷技術(shù)抗生素的不合理使用DNA雜交PCR檢測噬菌體介導(dǎo)第26頁/共52頁DNA雜交設(shè)計(jì)16SrRNA為探針16SrRNA在細(xì)菌中拷貝數(shù)極高，高度的保守性特異性不是很好必須結(jié)合PCR技術(shù)第27頁/共52頁P(yáng)CR檢測nestedPCR針對目的病原菌的不同保守區(qū)段設(shè)計(jì)多對引物每對引物都能特異的擴(kuò)增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加第28頁/共52頁P(yáng)CR技術(shù)也會產(chǎn)生假陽性新擴(kuò)增的目的DNA特異性不強(qiáng);退火溫度過低;模板中雜質(zhì)的污染。假陰性存在Taq酶的抑制劑；模板量過少；模板DNA純度不夠。第29頁/共52頁原位PCR(insituPCR,ISPCR)在細(xì)胞或細(xì)胞切片上對待測的低拷貝數(shù)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并通過原位雜交進(jìn)行檢測。不僅能檢測出病原微生物的存在，且能夠在組織細(xì)胞中定位。第30頁/共52頁噬菌體介導(dǎo)細(xì)菌檢測將熒光素酶基因引入到噬菌體的基因組，然后用轉(zhuǎn)基因噬菌體去侵染待測樣品。噬菌體侵染該宿主菌，大量合成包括熒光素酶在內(nèi)的由噬菌體基因編碼的蛋白，向體系中加入熒光素和ATP，就會有熒光產(chǎn)生。結(jié)核菌的檢測抗藥性菌株的檢測第31頁/共52頁熒光素酶熒光素＋ATP熒光利用宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯噬菌體基因熒光素酶基因宿主細(xì)菌噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌檢測第32頁/共52頁第三節(jié)DNA指紋DNA指紋是指對待測樣品中的DNA進(jìn)行分析所得到的具有特征性的DNA分子雜交圖譜。DNA酶解電泳轉(zhuǎn)膜雜交最常用的DNA探針是微衛(wèi)星序列。受害者血樣犯罪嫌疑人衣物上血樣犯罪嫌疑人血樣第33頁/共52頁第四節(jié)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA優(yōu)點(diǎn)：①一套引物可用于各種不同的核DNA；②無需構(gòu)建核基因庫，或進(jìn)行Southern雜交等復(fù)雜操作；③整個過程可以實(shí)現(xiàn)自動化。第34頁/共52頁第五節(jié)遺傳性疾病的分子診斷技術(shù)PCR－酶解鑒定PCR／OLA鑒定PCR-ELISA檢測同一基因中多個不同位點(diǎn)的突變的檢測第35頁/共52頁鐮刀形細(xì)胞貧血癥(sickle-cellanemia)典型的單基因遺傳性疾病血紅蛋白的β鏈（β珠蛋白）的第六個氨基酸Glu發(fā)生突變成Val。第36頁/共52頁血紅蛋白-鏈上谷氨酸變成纈氨酸第37頁/共52頁P(yáng)CR－酶解鑒定

正常基因?yàn)镃CTGAGG鐮刀形貧血病患者的基因?yàn)镃CTGTGG限制性內(nèi)切酶CvnI的識別序列為CCTNAGG第38頁/共52頁方法:在CvnI位點(diǎn)的兩點(diǎn)設(shè)計(jì)兩個引物;包含CvnI位點(diǎn)區(qū)域的DNA片段通過PCR擴(kuò)增出來;擴(kuò)增的DNA用CvnI酶處理，酶解產(chǎn)物用凝膠電泳分開，經(jīng)溴化乙錠染色后就可在紫外燈下檢查DNA帶型。第39頁/共52頁38225620118188條帶大小(bp)正常純合子雜合子突變純合子CvuI處理CvuICvuICvuI256bp201bp181bp88bpCvuICvuI256bp382bp88bp正常情況鐮刀形細(xì)胞貧血癥PCR擴(kuò)增引物1引物2PCR產(chǎn)物（長726bp）第40頁/共52頁P(yáng)CR/OLA鑒定OLA(oligo-nucleotideligationassay),寡聚核苷酸連接分析。假定一個正常的基因在一個特定的位置發(fā)生了突變，比如說150位的T突變?yōu)镚

。根據(jù)150位兩邊的序列，人工合成兩段短的核苷酸鏈，使這兩段寡聚核苷酸鏈與基因的一條鏈互補(bǔ)。探針X：寡聚核苷酸鏈的3’端最后一個核苷酸正好與正?；虻?50位的的核苷酸配對，探針Y：另一段寡聚核苷酸鏈的5’端第一個核苷酸與151位的核苷酸配對。第41頁/共52頁正?；?/p>

探針X3’端最后一個核苷酸就不會與目的基因150位的核苷酸配對由于3’最后一個核苷酸不配對而使兩個探針無法實(shí)現(xiàn)連接目的基因突變兩探針與目的基因的完美配對兩個探針就可連接起來加入DNA連接酶第42頁/共52頁B150151DBD150151BXY150151DBD雙鏈目的DNA或PCR產(chǎn)物熱變性單鏈目的DNA或PCR產(chǎn)物加探針退火完全配對模板有突變,不完全配對連接酶連接酶加入鏈霉抗生物素蛋白加入鏈霉抗生物素蛋白第43頁/共52頁BDB加入堿性磷酸酶加入無色底物加入堿性磷酸酶加入無色底物BDAP變色無色底物有色底物B保持無色無色底物PCR/OLA分析程序示意圖第44頁/共52頁P(yáng)CR-ELISA檢測在PCR反應(yīng)體系中加入生物素標(biāo)記的dUTP和其他3種dNTP3’端經(jīng)DIG標(biāo)記特異性探針包被有抗生物素抗體的酶標(biāo)板抗堿性磷酸酶（AP）－DIG抗體如果加入的DIG標(biāo)記的探針可與擴(kuò)增片段結(jié)合，則酶標(biāo)板上有顏色反應(yīng)發(fā)生，否則不會有顏色的變化。第45頁/共52頁同一基因中多個不同位點(diǎn)的突變的檢測擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplificationrefractorymutationsystem,ARMS）人工引入酶切位點(diǎn)（artificialintroductionofrestrictionsite,AIRS）直接測序法（directsequencing,DS）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－單鏈構(gòu)