酶促反應(yīng)動力學(xué)

酶促反應(yīng)動力學(xué)第1頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)；酶促反應(yīng)速度一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下，用單位時間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示；反應(yīng)速度取其初速度，即底物的消耗量很?。ㄒ话阍?﹪以內(nèi)）時的反應(yīng)速度；底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度。（[S]》[E]）研究前提二、底物濃度對酶反應(yīng)速率的影響第2頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三產(chǎn)物0時間初速度酶促反應(yīng)速度逐漸降低酶促反應(yīng)的時間進(jìn)展曲線第3頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三

在其他因素不變的情況下，底物濃度對反應(yīng)速度的影響呈矩形雙曲線關(guān)系。反應(yīng)初速度隨底物濃度變化曲線第4頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。[S]VVmax第5頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。[S]VVmax第6頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng)[S]VVmax第7頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三E+SESP+Ek1k2k3（一）中間復(fù)合物學(xué)說

k4三個假設(shè)：（1）E與S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)，而ES分解為E及P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速度取決于慢反應(yīng)即

V＝k3[ES]。（2）S的總濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段，S的濃度可認(rèn)為不變即[S]＝[St]。（3）P→0忽略這步反應(yīng)第8頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三（二）酶促反應(yīng)的動力學(xué)方程式1、米氏方程的推導(dǎo)第9頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程(Michaelisequation)。[S]：底物濃度V：不同[S]時的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]Km+[S]＝──第10頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三穩(wěn)態(tài)時ES濃度不變

反應(yīng)速度

V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的質(zhì)量平衡方程

[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3(Ⅲ)(Ⅰ)(Ⅱ)第11頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三第12頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三穩(wěn)態(tài)時ES濃度不變反應(yīng)速度

V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的質(zhì)量平衡方程

[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3V=V[S]Km+[S]米氏方程V=Vmax=k3[ES]max=k3[Et]Km=

k2+k3k1米氏常數(shù)第13頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三

a.當(dāng)[S]很小時V=V[S]/Km一級反應(yīng)反應(yīng)初速度隨底物濃度變化曲線米氏曲線V=V[S]Km+[S]b.當(dāng)[S]很大時V=V[S]/[S]=V

0

級反應(yīng)混合級第14頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三Km=?Km=[S]V=V[S]Km+[S]若V＝V/2V2＝V[S]Km+[S]1Km+[S]=2[S]第15頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三2、動力學(xué)參數(shù)的意義（1）米氏常數(shù)Km的意義Km＝[S]∴Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2第16頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三

①Km是酶的特性常數(shù)：

與pH、溫度、離子強(qiáng)度、酶及底物種類有關(guān)，與酶濃度無關(guān)，可以鑒定酶。酶底物Km(mmol/L)脲酶尿素25溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺0.006葡萄糖-6-磷酸脫氫酶6-磷酸-葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺2.5甲酰酪氨酰胺12.0乙酰酪氨酰胺32.0第17頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三②可以判斷酶的專一性和天然底物Km值最小的底物——最適底物/天然底物Km近似表示酶對底物的親和力：Km越大、親和力越小第18頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三Km=

k2+k3k1Km≈k2（分離能力）/k1（親合能力）E+SESP+Ek1k2k3Km越小，親和力越強(qiáng)。[S]很小時，反應(yīng)速度就能達(dá)到很大。性能優(yōu)，代謝中這類酶更為重要k2>>k3時第19頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三④Km可幫助判斷某代謝反應(yīng)的方向和途徑催化可逆反應(yīng)的酶對正/逆兩向底物Km不同

——Km較小者為主要底物③根據(jù)Km：判斷某[s]時v與Vmax的關(guān)系判斷抑制劑的類型第20頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三乳酸脫氫酶（1.7×10-5）丙酮酸脫氫酶（1.3×10-3）丙酮酸脫羧酶（1.0×10-3）丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛丙酮酸濃度較低時：代謝哪條途徑?jīng)Q定于Km最小的酶一底物多酶反應(yīng)第21頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三（2）Vmax和k3（kcat)的意義一定酶濃度下，酶對特定底物的Vmax也是一個常數(shù)。[S]很大時，Vmax＝k3[E]。k3表示當(dāng)酶被底物飽和時，每秒鐘每個酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，——又稱為轉(zhuǎn)換數(shù)、催化常數(shù)kcatkcat越大，酶的催化效率越高第22頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三（3）kcat/km的意義：V=Vmax[S]Km+[S]∵Vmax=kcat[Et]∴V=kcat[Et][S]Km+[S]當(dāng)[S]<<Km時，[E]＝[Et]第23頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三是E和S反應(yīng)形成產(chǎn)物的表觀二級速率常數(shù)。其大小可用于比較酶的催化效率。kcat/km＝

kcat/km的上限為k1,即生成ES的速率，即酶的催化效率不超過E和S形成ES的結(jié)合速率kcat/km的大小可以比較不同酶或同一種酶催化不同底物的催化效率。第24頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三（1）Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法3、Km與V的求取第25頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三第26頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三蔗糖酶米氏常數(shù)（Km）的測定1.配12支蔗糖底物溶液，濃度分別為0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M，在35℃水浴保溫；2.加入3U/ml已在35℃水浴保溫的酶溶液，準(zhǔn)確作用5分鐘，終止反應(yīng)；3.各吸取0.5ml反應(yīng)液與3，5-二硝基水楊酸，沸水浴5分鐘，冷卻后在540nm測定吸光度OD值；4.作圖

第27頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三（2）Eadie-Hofstee作圖法第28頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三vV[S]Vmax斜率－Km第29頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三

（3）Hanes-Woolf作圖法

第30頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三斜率=1/VmKm/Vm-Km[S]/V[S]第31頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三vVmax[S]－3Km－2Km－Km（4）Eisenthal和Cornish-Bowden線性作圖法第32頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三（三）多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)

分為單底物、雙底物和三底物反應(yīng)1.酶促反應(yīng)按底物分子數(shù)分類：第33頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三①有序反應(yīng)（orderedreactions）領(lǐng)先底物釋放釋放A和Q競爭地與自由酶結(jié)合（1）順序反應(yīng)或單－置換反應(yīng)2.多底物反應(yīng)按動力學(xué)機(jī)制分類：第34頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三②隨機(jī)反應(yīng)（randomreactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反應(yīng)第35頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三AAEPE’PEE’QEQEBB

A和Q競爭自由酶E形式

B和P競爭修飾酶形式E’A和Q不同E’結(jié)合

B和P也不與E結(jié)合。(2)乒乓反應(yīng)或雙－置換反應(yīng)第36頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三

三、酶的抑制作用失活作用：使酶Pr變性而引起酶活力喪失。抑制作用：使酶活力下降但不引起變性。抑制劑：能引起抑制作用的物質(zhì)。第37頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三

依據(jù)：

能否用透析、超濾等物理方法

除去抑制劑，使酶復(fù)活。不可逆抑制與可逆抑制（一）抑制作用的分類第38頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三1、不可逆抑制作用：抑制劑與酶必需基團(tuán)以牢固的共價鍵相連很多為劇毒物質(zhì)重金屬、有機(jī)磷、有機(jī)汞、有機(jī)砷、氰化物、青霉素、毒鼠強(qiáng)等。不可逆抑制第39頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三不可逆抑制劑

非專一性不可逆抑制劑（作用于一/幾類基團(tuán)）

專一性不可逆抑制劑（作用于某一種酶的活性部位基團(tuán)）不可逆抑制劑不可逆抑制第40頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三

（1）非專一性不可逆抑制劑①重金屬離子

Ag+、

Cu2+、

Hg2+、

Pb2+、

Fe3+

高濃度時可使酶蛋白變性失活；低濃度時對酶活性產(chǎn)生抑制。

——通過加入EDTA解除第41頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三

H2N-CH-COOHCH2

SH

H2N-CH-COOHCH2

S-CH2COOHICH2COOHHI②烷化劑（多為鹵素化合物）++碘乙酸第42頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三③有機(jī)磷化合物（敵百蟲、敵敵畏）第43頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三膽堿酯酶OHPOC2H5OC2H5S有機(jī)磷農(nóng)藥部分第44頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三膽堿乙酰化酶膽堿酯酶膽堿乙酰膽堿積累導(dǎo)致神經(jīng)中毒癥狀第45頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三如何緊急救治？排毒洗胃、喝雞蛋清牛奶導(dǎo)泄、利尿血液透析（清除游離狀態(tài)毒物）解毒藥：解磷定第46頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三ROOROOROXROO—EP+E—OHP+HX有機(jī)磷化合物羥基酶磷?；?失活)酸ROOROO—EP+-CHNOH磷?；?失活)N+CH3-CHNN+CH3OOROOR+E—OH

P解磷定解毒------解磷定(PAM)：第47頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三④有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物——與酶分子中-SH作用；

可通過加入過量巰基化合物解除。第48頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三⑤氰化物、硫化物和CO

——與酶中金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物如氰化物與含鐵卟啉細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合⑥青霉素（penicillin）與細(xì)菌糖肽轉(zhuǎn)肽酶Ser-OH活性，影響細(xì)胞壁合成。第49頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三（2）專一性不可逆抑制劑

①Ks型具有底物類似的結(jié)構(gòu)——（設(shè)計(jì)）帶有一活潑基團(tuán)：與必需基團(tuán)反應(yīng)（抑制）

∵利用對酶親合性進(jìn)行修飾∴親合標(biāo)記試劑（affinitylabelingreagent）第50頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三②Kcat型具有底物類似的結(jié)構(gòu)本身是酶的底物還有一潛伏的反應(yīng)基團(tuán)“自殺性底物”

第51頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三

抑制作用可通過透析等方法除去。原因：非共價鍵結(jié)合可逆抑制競爭性抑制(competitiveinhibition)非競爭性抑制(non-competitiveI.）反競爭性抑制(uncompetitiveI.)

2、可逆抑制作用：第52頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三（1）競爭性（Competitive)抑制第53頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三I：抑制劑（inhibitor）第54頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三第55頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三【舉例】

丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶琥珀酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸琥珀酸第56頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三

磺胺類藥物的抑菌機(jī)制：與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶二氫蝶呤啶＋對氨基苯甲酸＋谷氨酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸第57頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三利用競爭性抑制是藥物設(shè)計(jì)主要思路磺胺類藥抗菌機(jī)理：（與對氨基苯甲酸是結(jié)構(gòu)類似物）競爭性抑制細(xì)菌葉酸形成，抑制細(xì)菌繁殖人通過食物直接補(bǔ)充葉酸，對人無毒害。第58頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三生物堿麻醉—競爭性替代生物堿—嗎啡、海洛因、可卡因、尼古丁

嗎啡海洛因第59頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三抑制物（2）非競性（Non-competitive)抑制無法形成產(chǎn)物第60頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三Noncompetitiveinhibition第61頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三第62頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三（3）反競爭性（Uncompetitive）抑制第63頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三第64頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三第65頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三1：反應(yīng)體系不加I2：體系中加入一定量不可逆抑制劑3：體系中加入一定量可逆抑制劑v123[E](三)可逆和不可逆抑制作用的鑒別第66頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三[E]v不可逆抑制劑的作用[E]v可逆抑制劑的作用[I]→[I]第67頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三(四）可逆抑制作用動力學(xué)第68頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三1.競爭性抑制第69頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三斜率斜率第70頁，共84頁，2023年，2月20日，星期三Km變大，Vmax不變第71頁，共84頁，2023年，2月20日，