生物素親和素系統(tǒng)

生物素-親和素系統(tǒng)親和素鏈霉親和素生物素生物素衍生物及配體連接生物素親和素系統(tǒng)的應(yīng)用鏈霉親和素磁珠制備鏈霉親和素包被板制備生物素連接抗原/抗體實(shí)驗(yàn)生物素—鏈霉親和素系統(tǒng)在項(xiàng)目的試驗(yàn)

鄭州安圖生物2008年親和素(Avidin)一、來源：親和素主要存在于雞蛋清中，可通過離子交換和分子篩方法提純，從1L蛋清中可提取純親和素15-25mg。親和素可以在PH5-7的高鹽緩沖液中結(jié)晶出來，但沒有報(bào)道在等電點(diǎn)附近的緩沖液中可以結(jié)晶析出。二、分子量：親和素由四個(gè)相同的亞單位組成，每個(gè)亞單位的肽鏈中有128個(gè)氨基酸殘基，其中每條肽鏈含4個(gè)甘露糖，3個(gè)氨基葡糖，含糖量達(dá)1O%。每個(gè)亞單位的分子量約為15600，整個(gè)親和素分子的分子量66000-69000。三、親和力：親和素的每個(gè)亞單位可結(jié)合一個(gè)生物素分子，即一個(gè)AV可結(jié)合4個(gè)生物素分子，二者之間的親和力極強(qiáng)，親和素常數(shù)（Ka）為10^15Ｌ／mol，比抗原與抗體間的親和力（Ka＝10^5～11L／mol）至少高1萬倍，因此二者的結(jié)合特異性高和穩(wěn)定性好。1mg純的親和素的活性約為13—15U。三、等電點(diǎn)：PH=10.5四、活性基團(tuán)：親和素對官能團(tuán)的修飾不敏感，對其20%的羧基基團(tuán)進(jìn)行脂化和59%的氨基基團(tuán)進(jìn)行酰胺化都不會影響其與生物素的結(jié)合。但是當(dāng)對色氨酸和賴氨酸殘基進(jìn)行修飾時(shí)會顯著影響其與生物素的結(jié)合活性。即使用對色氨酸特異性的2-hydroxy-5-nitrophenylbromide試劑對親和素每個(gè)亞基上的一個(gè)色氨酸氧化，親和素就完全喪失了與生物素的結(jié)合能力。賴氨酸對親和素與生物素的結(jié)合也起著重要作用，氨基特異性試劑2，4二硝基氟苯與游離親和素的反應(yīng)較結(jié)合生物素的親和素反應(yīng)速度快說明了這一點(diǎn)。當(dāng)每個(gè)親和素亞基上引入二硝基基團(tuán)后，親和素的活性就會消失，證明親和素亞基上的3個(gè)賴氨酸殘基可能在生物素的結(jié)合位點(diǎn)。但是像三硝基氟苯和丹磺酰氯由于不易接近生物素的結(jié)合位點(diǎn)附近的賴氨酸殘基因此不會對親和素的活性造成影響。五、穩(wěn)定性：親和素對6M尿素和3M鹽酸胍有耐受性，當(dāng)鹽酸胍濃度至3.5M時(shí)其生物素結(jié)合能力下降，至6M時(shí)四聚體降解為單體，但是當(dāng)鹽酸胍濃度再降低至3M時(shí)其結(jié)合生物素的能力又能恢復(fù)。親和素與生物素的結(jié)合能力很強(qiáng)，在8M鹽酸胍PH1.5條件下，親和素與生物素可以完全解離。六、親和素-生物素復(fù)合物穩(wěn)定性：生物素-親和素是已知的蛋白和配體間非共價(jià)結(jié)合的最強(qiáng)作用力（Ka=10^15M-L)，生物素和親和素間的結(jié)合很迅速，而且一旦結(jié)合，不易受PH，溫度，有機(jī)溶劑及蛋白酶的影響。溫度、鹽的影響：游離親和素在85℃就會失活，但是生物素-親和素復(fù)合物可在短時(shí)間內(nèi)耐受132℃的高溫。生物素-親和素復(fù)合物對熱的耐受能力依賴于鹽的存在，在沒有鹽存在時(shí)，100℃10分鐘約有88%的生物素-親和素復(fù)合物解離，但在有鹽存在的條件下，需120℃15分鐘復(fù)合物才能完全解離。PH、變性劑影響：生物素-親和素復(fù)合物在PH2-13或8M鹽酸胍（中性）條件下不會受到影響，并可以用硫酸鋅沉淀，但是沉淀出的復(fù)合物用70%蟻酸處理1小時(shí)會使親和素不可逆失活。表面活性劑影響：C14

標(biāo)記的親和素與固相生物素的結(jié)合不受1%SDS,Tween20,Tween40,TritonX-100和兩性表面活性劑的影響。而生物素化蛋白與固相親和素的結(jié)合會受這些表面活性劑的影響而減弱，易于解離。因此將生物素化蛋白從固相親和素上解離使用SDS和高溫（95.6）即可。暗示親和素與生物素化分子的結(jié)合會受表面活性劑的影響而降低。七、親和素與生物素結(jié)合的隨機(jī)性：盡管親和素與生物素結(jié)合時(shí)需要親和素亞基間的相互作用，但是多種實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明親和素與生物素的結(jié)合是隨機(jī)的，即當(dāng)一個(gè)亞基結(jié)合生物素后不會對其他亞基與生物素的結(jié)合造成影響，而鏈霉親和素與生物素的結(jié)合具有協(xié)同效應(yīng)。鏈霉親和素(Streptavidin)一、來源：鏈霉親和素是Streptomyces

avidinii菌培養(yǎng)過程中的分泌產(chǎn)物，主要通過2一亞氨基生物素親和層析法提純，1L培養(yǎng)液中含蛋白10-60mg；目前也有基因重組技術(shù)表達(dá)的鏈霉親和素。二、分子量：一條完整的SA肽鏈中有159個(gè)氨基酸殘基，其中甘、丙氨基酸含量較大，且又不含任何糖基，分子量為16450。SA在培養(yǎng)過程中受蛋白酶的作用，肽鏈可從N端的lO～l2位和G末端19-21位處斷裂，使每條肽鏈只含125-127個(gè)氨基酸殘基，分子量降為13O96～13254，此即核心SA，核心SA的分子量約54KD。后者的每條肽鏈仍可結(jié)合一個(gè)生物素分子，即一個(gè)完整的核心SA仍可結(jié)合4個(gè)生物素分子。三、活性：SA和AV的活性都是結(jié)合生物素的量來表示，1mg蛋白結(jié)合生物素的微克數(shù)就是該蛋白的活性單位。從分子量計(jì)算，AV的最高活性是15u，完整SA是14u，核心SA的分子量較低，最高活性可達(dá)l8u，但由于1分子蛋白都結(jié)合4分子生物素，故它們的應(yīng)用效果相同。AV的活性基團(tuán)是肽鏈中的4個(gè)色氨酸殘基，SA的活性基團(tuán)也是肽鏈中的色氨酸殘基，當(dāng)用對色氨酸特異的Koshlands試劑處理后，SA就喪失了和生物素結(jié)合的能力。最近實(shí)驗(yàn)又顯示，酪氨酸殘基對蛋白的活性也有作用，AV的每條肽鏈中只有一個(gè)酪氨酸殘基(Tyr)，硝基苯磺酰氟(Nbs-F)只要平均修飾它的0.5個(gè)Tyr，就可使其完全失去活性。SA的每條肽鏈中含6個(gè)Tyr殘基，Nbs-F也修飾其中的一半即3個(gè)可便SA失去結(jié)合生物素活性。鏈霉親和素（SA）結(jié)構(gòu)圖四：等電點(diǎn)：PH=6.0在ELISA中的應(yīng)用：由于SA的等電點(diǎn)低，表面帶的正電荷少，因此它和聚苯乙烯板載體的靜電吸附力弱，SA的陰性對照顯色明顯比AV低，這樣在ELIsA上應(yīng)用SA可進(jìn)一步提高方法的靈敏度。親和素與鏈霉親和素的比較相同點(diǎn)：1、生物素結(jié)合能力：AV:13-15U,SA:14-18U2、活性中心依賴于色氨酸-賴氨酸：親和素在氨基酸序列的70-70和110-111兩個(gè)位點(diǎn)含有色氨酸-賴氨酸，鏈霉親和素在氨基酸序列的79-80和120-121兩個(gè)位點(diǎn)含有色氨酸-賴氨酸，但是親和素較鏈霉親和素更易于被N-溴代琥珀酰亞胺氧化。不同點(diǎn)：1、分子量：AV=66KD-69KD，SA=54KD2、等電點(diǎn)：AV=10.5，SA=6.0，AV帶正電較多，非特異性結(jié)合較強(qiáng)，可通過醋酸酐等修飾降低表面所帶正電荷，增加親和素稀釋液的PH和離子強(qiáng)度降低非特異性結(jié)合。3、位阻效應(yīng)：SA的生物素結(jié)合位點(diǎn)較AV深，位阻效應(yīng)較強(qiáng)，長臂生物素更適合。4、生物素的結(jié)合：AV隨機(jī)結(jié)合，SA協(xié)同結(jié)合。5、氨基酸序列：AV含二硫鍵和10%糖，SA含甘氨酸丙氨酸較多，無糖和二硫鍵。親和素和鏈霉親和素氨基酸序列對比生物素（Biotin）1、概念：生物素(biotin)是動、植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H。2、分子式：

C10H16O3N2S分子量：244.313、結(jié)構(gòu)式：咪唑酮環(huán)結(jié)合親和素，四氫噻吩環(huán)側(cè)鏈末端羧基結(jié)合蛋白質(zhì)5、溶解特性：難溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜（DMSO)6、等電點(diǎn)：

PH=3.57、其它特性：羧基需經(jīng)活化修飾才能結(jié)合蛋白質(zhì)（羧基活化的生物素，稱為活化生物素，也叫生物素衍生物）生物素衍生物的種類及特性按照生物素衍生物所結(jié)合的官能團(tuán)種類主要有以下幾種：1、結(jié)合氨基的生物素衍生物2、結(jié)合羰基（羧基、醛基、酮基）的生物素衍生物3、結(jié)合巰基的生物素衍生物4、結(jié)合酪氨酸和組氨酸殘基的生物素衍生物5、結(jié)合核酸的生物素衍生物結(jié)合氨基的生物素衍生物1、生物素Ｎ－羥基丁二酰亞胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）

不溶于水，一般以DMF或DMSO溶解，可滲透過細(xì)胞膜，用于細(xì)胞內(nèi)部蛋白的標(biāo)記。MolecularWeight:341.38SpacerArmLength:13.5?2、Biotinamidohexanoyl-6-aminohexanoicacidN-hydroxysuccinimide

(B-LC-LC-NHS)MolecularWeight:567.70SpacerArmLength:30.5?在B-NHS分子中增加了2分子6-氨基己糖，增加了生物素與被標(biāo)記蛋白間的距離，降低位阻效應(yīng)（stetichindrance)。MolecularWeight:443.43SpacerArm:13.5?3、Biotin3-sulfo-N-hydroxysuccinimideestersodiumsalt

(B-Sulfo-NHS)可溶于水，不能透過細(xì)胞膜，可用于細(xì)胞表面蛋白的標(biāo)記。4、succinimidyl-2-(biotinamido)ethyl-1,3-dithiopropionate

(B-SS-NHS)MolecularWeight:504.65SpacerArm:24.3?分子中的二硫鍵可以用DTT斷開，使生物素化的蛋白與生物素分開，適用于親和層析。結(jié)合氨基的生物素衍生物特點(diǎn)：1、對水和濕度敏感，用前應(yīng)充分平衡至室溫，避免吸潮。2、易水解，水解后失去活性，水解速度隨PH值的升高而加快。中性PH的半衰期為2-4小時(shí)，PH=9時(shí)半衰期只為幾分鐘，所以應(yīng)在使用前配置，未用完的試劑丟棄。3、不能使用含有游離氨基的緩沖液，如tris或甘氨酸緩沖液，因?yàn)檫@些緩沖液的氨基會與被標(biāo)記物競爭反應(yīng)，一般使用PBS、CB、MES緩沖液。4、與氨基反應(yīng)的最適PH為7-9。5、適合結(jié)合中性偏堿性的蛋白。B-NHS與抗體的偶聯(lián)抗體分子上的氨基末端和賴氨酸上均含有游離的氨基，抗體的分子量較大，有豐富的氨基可供標(biāo)記。下圖顯示抗體上可以被標(biāo)記的位點(diǎn)：所需試劑：DMSO或DMFPBS或其他不含氨基緩沖液，PH7-8透析袋/透析液0.05mol/L,pH7.2的PBS操作程序：按照下面的操作方法，大概每分子蛋白上會連接3-5個(gè)生物素。對于抗體這樣的大分子蛋白，一般每個(gè)抗體分子上會連接約8-12個(gè)生物素。B-NHS與蛋白的比例可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整。A、計(jì)算B-NHS的使用量要根據(jù)被標(biāo)記的蛋白的量和濃度計(jì)算。通過控制B-NHS和蛋白的量可以控制標(biāo)記的程度。當(dāng)標(biāo)記較低濃度的蛋白的時(shí)候需要更多的B-NHS以達(dá)到相同的標(biāo)記效果。一般為達(dá)到最好的標(biāo)記效果，對于10mg/ml蛋白，B-NHS的使用量≥12mol倍，對于2mg/ml蛋白，B-NHS的使用量≥20mol倍，示例：1ml2mg/mlIgG(150000MW)溶液，需要約27ul10mMB-NHS。1mlIgG×××

＝0.000266mmol2mgIgG1mlIgG1mmolIgG150000mgIgG20mmolB-NHS1mmolIgGB-NHS與抗體的偶聯(lián)方法：0.00026mmolB-NHS××=26.6ulB-NHS1000000ulLL10mmolB、連接反應(yīng)1、若B-NHS凍存，試驗(yàn)前平衡至室溫。2、將蛋白用PBS溶解至2mg/ml。注：如果蛋白已經(jīng)用PH7.2-8不含氨基的緩沖液溶解，可直接使用或用PBS稀釋至所需濃度。若蛋白稀釋液中含氨基的緩沖液，則需用PH7.2-8PBS緩沖液透析。3、使用前，將B-NHS用DMSO或DMF溶解至10mM。對于B-NHS，2.0mg溶解于590ul溶劑中即可。4、按照蛋白的量，向蛋白溶液中加入計(jì)算好的10mMB-NHS。5、冰浴反應(yīng)2小時(shí)或室溫反應(yīng)30分鐘。注：只要蛋白不降解或長菌，可延長反應(yīng)時(shí)間。6、透析去除未反應(yīng)或水解的生物素。盡管B-NHS是最常用的生物素衍生物，因?yàn)槎鄶?shù)蛋白都含有游離氨基，但是對于有些蛋白，游離氨基位于活性位點(diǎn)附近或參與活性位點(diǎn)，對其修飾就會造成蛋白失活。對于抗體的偶聯(lián)，如果抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)附近富含賴氨酸，抗體的活性就會受到影響，這時(shí)應(yīng)該考慮用其他生物素衍生物進(jìn)行偶聯(lián)。1、Biotinhydrazide（BHZ，生物素酰肼）

MolecularFormula：C10H18N4O2S

MolecularWeight：258.34

solubility

：DMSO≤20

mg/mL

結(jié)合羰基的生物素衍生物BHZ是水合肼(hydrazinehydrate)與生物素的合成物，因在生物素的羧基側(cè)鏈上帶有肼基，故能標(biāo)記帶醛基的蛋白質(zhì)。

2、Biotinamidohexanoicacidhydrazide

（長臂生物素酰肼）

N-(+)-Biotinyl-6-aminohexanoichydrazide

MolecularFormula：C16H29N5O3S

MolecularWeight：371.50

Solubility：DMSO25

mg/mL

長臂生物素酰肼是在生物素和肼基中間增加了一個(gè)氨基己酸，增長了鍵長，可減少位阻效應(yīng)。3、Biocytin

hydrazidehydrochloride（BCHZ，肼化生物胞素）

Nε-(+)-Biotinyl-L-lysinehydrazidehydrochloride

MolecularFormula：C16H30N6O3S·HCl

MolecularWeight：422.97生物胞素為ε生物素賴氨酸，是生物素通過C=O基與賴氨酸的ε-氨基連接生成的化合物。BCHZ可與蛋白質(zhì)的醛基和氨基結(jié)合，

生物素酰肼特點(diǎn)：1、末端含有氨基，可以通過EDC在PH4.5-5的MES緩沖液中與羧基反應(yīng)形成酰氨鍵。反應(yīng)中避免使用含有氨基（Tris、Glycine）和羧基（acetate、citrate）的緩沖液。2、末端的肼基可在PH接近中性（6.5-7.5）的緩沖液中與羰基（醛基、酮基）反應(yīng)形成腙。3、適合標(biāo)記糖蛋白、偏酸性的蛋白、酶、DNA。4、在水中的溶解性較差，小于5mM，在DMSO中溶解度可達(dá)到50mM。EDC連接含氨基和羧基分子的反應(yīng)示意圖Biotinhydrazide與含羧基分子的偶聯(lián)：所需試劑：生物素酰肼：50mM生物素酰肼（DMSO溶解）MES緩沖液：0.1MMES,PH4.7-5.5。EDC溶液：EDC溶解于MES緩沖液中，終濃度約0.5M。配后立即使用。透析袋：10KD操作步驟：1、將蛋白（或含羧基分子）溶解于MES緩沖液中，濃度為5-10mg/ml。2、向1ml蛋白溶液中加入25ul生物素酰肼，混勻。3、向1ml蛋白溶液中加入12.5ulEDC溶液，混勻。4、室溫振蕩反應(yīng)2小時(shí)或過夜。5、離心去除反應(yīng)中產(chǎn)生的沉淀，透析去除未反應(yīng)物質(zhì)。生物素酰肼與糖蛋白偶聯(lián)方法：所需試劑：生物素酰肼：50mM生物素酰肼。氧化緩沖液：0.1M醋酸鹽緩沖液，PH5.5過碘酸鈉溶液：20mM過碘酸鈉，用氧化緩沖液溶解。使用前配置，用棕色瓶，避光。連接反應(yīng)緩沖液：0.1MPBS緩沖液，0.15MNaCl，PH7.2，或其他中性偏堿性不含氨基緩沖液。糖蛋白溶液：2mg/ml，糖蛋白溶解在氧化緩沖液中。透析袋：分子量10kD操作步驟：1、向1ml涼的糖蛋白溶液中加入1ml涼的過碘酸鈉溶液，混勻后4度或冰上避光反應(yīng)30分鐘。注：如果僅氧化硅酸基團(tuán)，加50ul過碘酸鈉溶液即可（過碘酸鈉終濃度為1mM，而非10mM)。2、用連接反應(yīng)緩沖液透析以除去多余的過碘酸鈉并更換樣本緩沖液。3、將50mM（12.9mg/ml)生物素酰肼和活化并透析過的糖蛋白1：9混合室溫反應(yīng)2小時(shí)。(注：最適的生物素酰肼和糖蛋白濃度需要通過實(shí)驗(yàn)確定）4、通過透析去除未反應(yīng)的物質(zhì)。生物素化的樣本可以和未生物素化的樣本保存條件相同。長臂生物素酰肼與糖蛋白偶聯(lián)反應(yīng)示意圖IgG抗體分子中含有糖基和羧基因此可以使用生物素酰肼進(jìn)行偶聯(lián)，由于糖基位于IgG分子的Fc片斷，遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點(diǎn)，因此將抗體用過碘酸鈉氧化后與生物素酰肼偶聯(lián)不會影響與抗原的結(jié)合活性。此方法更適合于多克隆抗體，因?yàn)槎嗫沟奶腔捷^單抗高。下圖是多抗包被在肼基磁珠上的反應(yīng)示意圖：比較B-NHS和B-Hydrozide與抗體的偶聯(lián)，前者相當(dāng)于隨機(jī)偶聯(lián)，后者相當(dāng)于定點(diǎn)偶聯(lián)。下面的表是研究者用3種偶聯(lián)方法將抗鼠抗體偶聯(lián)在磁珠表面的偶聯(lián)效率的比較：以上的結(jié)果表明：3種偶聯(lián)方法將抗鼠多抗偶聯(lián)在磁珠表面的效率差別并不明顯，但是3種方法偶聯(lián)的抗鼠抗體對鼠IgG抗體的結(jié)合效果不同，定點(diǎn)偶聯(lián)是隨機(jī)偶聯(lián)效果的1.6-1.7倍。說明隨即偶聯(lián)的抗體影響了其與抗原的結(jié)合。結(jié)合巰基的生物素衍生物1、Biotin-maleimide

(生物素-馬來酰亞胺）N-Biotinoyl-N′-(6-maleimidohexanoyl)hydrazide

MolecularFormula：C20H29N5O5S

MolecularWeight：451.54

solubility

：aceticacid:20

mg/mL

2、1-Biotinamido-4-[4′-(maleimidomethyl)cyclohexanecarboxamido]butane

Biotin-BMCCFormula:C26H39N5O5SMolecularWeight:533.68SpacerArmLength:32.6?Solubility:~4.5mg/ml(8.5mM)inDMSO(slightlylesssolubleinDMF)3、BiotinPolyethyleneoxideIodoacetamide

Formula:C18H31IN4O5SMolecularWeight:542.43SpacerArm:24.7?NetMassAddition:414.19Solubility:≥25mg/mlinwaterorbuffer結(jié)合巰基的生物素衍生物的特點(diǎn)1、Biotin-BMCC和IodoacetylBiotin對濕度敏感，在水相中易水解，使用前應(yīng)充分恢復(fù)至室溫。未使用完的試劑應(yīng)丟棄，不可存放。2、馬來酰亞胺基團(tuán)在PH6.5-7.5的緩沖液中與游離巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵，

PH＞7.5時(shí)與氨基的反應(yīng)和水解反應(yīng)增強(qiáng)。在PH=7.0時(shí)馬來酰亞胺與巰基的反應(yīng)是與氨基反應(yīng)的1000倍。3、iodoacetyl基團(tuán)在PH7.5-8.5緩沖液中與巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵，此反應(yīng)是巰基取代碘的親和取代反應(yīng)，iodoacetyl摩爾數(shù)應(yīng)略高于巰基。在沒有巰基存在PH6.9-7.0的條件下，也可以與組氨酸反應(yīng)，但反應(yīng)速度慢（一周）。Iodoacetyl基團(tuán)也可以在PH＞10時(shí)與氨基反應(yīng)。4、多數(shù)蛋白中都含有半胱氨酸，但巰基都以二硫鍵的形勢存在，需要用還原劑還原后才能與結(jié)合巰基的生物素衍生物反應(yīng)，常用的還原劑是TCEP和MEA。也可以通過試劑SATA引入巰基。由于蛋白中的巰基都是以二硫鍵的形式存在，所以在偶聯(lián)前應(yīng)先將二硫鍵還原為巰基。以IgG抗體為例，IgG抗體的Fc和Fab片斷均含有二硫鍵，如果二硫鍵全部被還原抗體就會失活，所以需用對IgG抗體Fc片斷特異的溫和還原劑2-MEA還原。2-MEA還原抗體的程序如下：操作程序：1、秤量6mg2-MEA放入容器中，向其中加入1mlIgG。2、蓋好，振蕩溶解2-MEA，置37度溫箱中反應(yīng)90分鐘。3、反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，透析(透析液中含10mMEDTA）或過柱去除2-MEA。4、將活化過的IgG用PBS-EDTA稀釋至所需濃度，立即使用。IodoacetylBiotin與抗體的偶連：操作程序：1、使用前配制4mMIodoacetylBiotin。

2mgIodoacetyl-LC-Biotin溶解于1mlDMF。

2.2mgIodoacetyl-PEO2-Biotin溶解于1ml反應(yīng)緩沖液。2、每ml還原的抗體中加入50ulIodoacetylBiotin溶液。3、室溫避光震蕩反應(yīng)90分鐘。4、透析去除未反應(yīng)的物質(zhì)。IodoacetylBiotin與含巰基分子反應(yīng)示意圖上圖顯示了B-NHS、B-HZ、B-BMCC偶聯(lián)抗體后與Streptavidin反應(yīng)的模式，從圖上可以看出，B-NHS與抗體屬于隨機(jī)偶聯(lián)，可能影響抗體與抗原的結(jié)合，而B-HZ、B-BMCC與抗體屬于定向偶聯(lián)，抗原結(jié)合位點(diǎn)暴露充分。結(jié)合酪氨酸和組氨酸的生物素衍生物p-diabenzoyl

biocytin（DBB）MolecularWeight：539.05SpacerArmLength：27.9?p-diabenzoyl

biocytin（DBB）由生物胞素苯甲酰胺通過鹽酸和亞硝酸鈉重氮化反應(yīng)制得，可以與酪氨酸的酚羥基鄰位、組氨酸的咪唑基和色氨酸的吲哚環(huán)反應(yīng)。文獻(xiàn)介紹可以用來標(biāo)記T3。重氮法連接酪氨酸、組氨酸、色氨酸反應(yīng)圖文獻(xiàn)中重氮法生物素化T3的制備所需試劑：1、對氨基苯乙胺（APEA)CAS:13472-00-92、NHS-LC-Biotin3、NaHCO34、無水乙醇5、HCL6、NaNO27、DMF8、尿素試劑準(zhǔn)備：1、對氨基苯乙胺溶解在DMF中，濃度為1.0%。2、NHS-LC-Biotin溶解在DMF中，濃度為1.12%。3、4%NaNO2溶液。4、2MHCL。5、T3溶解在2MNaOH溶液中，濃度為1.3%。制備程序：1、1mlAPEA溶液逐滴加入2.2mlNHS-LC-Biotin溶液中，震蕩反應(yīng)1小時(shí)。2、用NaHCO3緩沖液調(diào)節(jié)PH值到8.5。3、用無水乙醇將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來。4、0.02mM生物素化的APEA用1ml2MHCL溶解，然后冰浴環(huán)境中逐滴加入5mlNaNO2溶液。5、過量的硝酸用20mg尿素去除。6、混合物在低溫環(huán)境中震蕩反應(yīng)2小時(shí)，結(jié)束后用200mgNaHCO3中和至中性。7、重氮鹽逐滴加入1mlT3溶液中，震蕩反應(yīng)3小時(shí)。結(jié)合核酸的生物素衍生物1、PhotoactivatableBiotin（光敏生物素）MolecularWeight：533.65SpacerArmLength：30?Storage：storeproductprotectedfromlightat-20°C光敏生物素特點(diǎn)：1、硝基苯疊氮基團(tuán)是光敏生物素的活性基團(tuán)，在350nm波長的可見光下可被激活，可以與蛋白、雙鏈DNA或單鏈DNA、RNA偶聯(lián)。2、偶聯(lián)方法簡單，只需將光敏生物素與被偶聯(lián)物混合放置350nm波長的可見光下即可，而且在這種物理?xiàng)l件下不會對分子結(jié)構(gòu)造成改變。3、樣品放置在紫外光下幾分鐘會變熱，所以應(yīng)讓反應(yīng)在冰浴環(huán)境下進(jìn)行。4、反應(yīng)的樣本中不能含有帶巰基的還原劑（DTT、2-MEA），他們會將疊氮基還原為氨基，影響光敏活化。5、在光活化反應(yīng)中不能使用帶有氨基的緩沖液（Tris、Glycine），硝基苯疊氮基團(tuán)與氨基的反應(yīng)會成為主要反應(yīng)，從而影響了與目的基團(tuán)的反應(yīng)。2、1-(4-azidosalicylamido)-6(biotinamido)-hexane

Biotin-LC-ASAMolecularWeight

：503.62SpacerArmLength：29.9?Storage：

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