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文檔簡介

堿性磷酸酶Km值的測定【實驗目的】1.了解酶的Km值測定原理和方法2．掌握堿性磷酸酶（AKP）活性測定的原理和方法【實驗原理】在溫度，PH及酶濃度恒定的條件下，酶促反應的初速度隨底物濃度（S）增大而增加，但當底物濃度增大到一定極限時，則反應速度趨于恒定，此最大反應速度Vmax，反應速度與底物濃度之間的關系可用米氏方程來表示，即：將米氏方程變形為雙倒數方程，以l/v－1／[s]作圖，將各點連線，在橫軸截距為-／km，據此可算出Km值。1/V=Km/Vmax?[S]+1/Vmax

本實驗以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉為其底物，生成酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4一氨基安替比林作用，經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌的衍生物，根據紅色的深淺可測出酶活力高低。其反應式如下：

磷酸苯二鈉+H2OAKPOH-苯酚

苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6醌衍生物（紅色）管號12345678底物液(0.04M)碳酸緩液(pH=10)蒸餾水0.050.150.250.300.400.600.800.00

0.900.900.900.900.900.900.900.90

0.950.850.750.700.600.400.201.00混勻后37℃水浴，預溫5分鐘左右

【實驗操作】酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1加入酶液后立即混勻（保持37℃水?。?，反應開始。從加入酶液起計時至下一步加入堿性溶液停止反應，各管反應時間應準確一致，為15分鐘。結果記錄12345678OD底物濃度mmol/L1356812160

1/[S]1/OD10.3330.2000.1670.1250.0830.063-【實驗結果】1、原始數據2、作圖以[s]為橫軸，OD510為縱橫作圖，觀察曲線形狀；查Km值以1／［s]為橫軸，1／OD510為縱軸作

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