酶快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第一章課件

酶快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)KineticsofFastEnzymeReaction第一章緒論IntroductiontoEnzymeKinetics酶反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)和瞬變動(dòng)力學(xué)

酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是解釋酶反應(yīng)機(jī)制具有代表性的方法。酶動(dòng)力學(xué)包括兩個(gè)方面，即酶的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)（Steady-statekinetics）和預(yù)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)（Pre-steadystatekinetics），后者也叫瞬變動(dòng)力學(xué)（Transientkinetics）。酶的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)的基本目標(biāo)是對(duì)酶催化的總反應(yīng)進(jìn)行測(cè)量與分析，只涉及底物與產(chǎn)物，而不考察酶分子本身。預(yù)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)可以直接研究總反應(yīng)中所包含的分步反應(yīng)。研究者的興趣所在是酶分子本身所發(fā)生的變化或能夠反映這種變化的變化上。兩種動(dòng)力學(xué)方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)由于所要求酶制劑用量少，且不需要使用特殊的儀器設(shè)備，因而長(zhǎng)久以來(lái)獲得了廣泛的應(yīng)用。這種方法的缺點(diǎn)在于研究人員所獲得的信息是間接的，有時(shí)也是不確切的。預(yù)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)由于測(cè)量快速反應(yīng)，而需要特殊的儀器設(shè)備（例如，停流裝置）。它的優(yōu)點(diǎn)是可以提供用來(lái)解釋復(fù)雜反應(yīng)機(jī)制的信息。應(yīng)該指出，兩種方法是相輔相成的，對(duì)于研究酶反應(yīng)來(lái)說(shuō)都很重要。當(dāng)?shù)孜餄舛雀邥r(shí)，水解速度保持恒定。2.反應(yīng)速度與酶濃度成正比；3.產(chǎn)物的加入引起反應(yīng)速度的減少，在低底物濃度時(shí)，減少尤明顯。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以用下面兩種反應(yīng)機(jī)制解釋,機(jī)制I:(1.1.1)(1.1.2)機(jī)制II:

(1.1.3)

(1.1.4)

如果考慮產(chǎn)物與酶結(jié)合生成EP，那么要把下述平衡包括到上述每一個(gè)機(jī)制中去，(1.1.5)

在上述兩種機(jī)制中，ES符合物的形成是共同的，然而所起的作用卻是完全不同的。在機(jī)制I中，產(chǎn)物的形成是通過(guò)一個(gè)雙分子過(guò)程（1.1.2式），即酶與底物的碰撞。在此種情況下，ES符合物是無(wú)意義的，它通過(guò)減少E濃度而降低產(chǎn)物的形成速度。另一方面，在機(jī)制II中，ES是至關(guān)重要的符合物，經(jīng)過(guò)一個(gè)單分子過(guò)程（1.1.4式），ES復(fù)合物形成產(chǎn)物。下面要推導(dǎo)出能同時(shí)滿足上述兩種機(jī)制的速度方程。當(dāng)考慮EP復(fù)合物的形成時(shí)，酶以三種形式存在：E,ES和EP。因此，酶的總濃度為e0=[E]0=[E]+[ES]+[EP](1.1.6)假定在酶反應(yīng)中，下述平衡迅速建立起來(lái)

應(yīng)用質(zhì)量作用定律，有(1.1.7)(1.1.8)其中，m和n為平衡常數(shù)，x為底物在時(shí)間t時(shí)的濃度，那么，[S]=a-x，這里a為底物起始濃度。[P]=x,這是兩個(gè)可以測(cè)量的量。式1.1.6,1.1.7和1.1.8組成一個(gè)聯(lián)立方程組，含有三個(gè)未知量。{E]和[ES]的表達(dá)式為，(1.1.9)(1.1.10)利用1.1.9和1.1.10式，產(chǎn)物P生成的速度方程可以推倒如下，對(duì)于機(jī)制I,P通過(guò)一個(gè)雙分子過(guò)程形成，產(chǎn)物的生成速度為(下面式子應(yīng)為k’+1)

對(duì)于機(jī)制II，產(chǎn)物以單分子過(guò)程形成(1.1.4式)，產(chǎn)物的生成速度為：

(1.1.11)和(1.1.12)式僅差一個(gè)常數(shù)。為簡(jiǎn)化起見(jiàn)，只考慮反應(yīng)的初相，可忽略產(chǎn)物的形成，因而[P]=x可以略去。在t=0時(shí)，初始速度為，初始底物濃度為s0，ES解離常數(shù)為Ks=1/m,(1.1.11)(1.1.12)二.MichaelisandMenten的工作

1913年MichaelisandMenten重新做了蔗糖反應(yīng)轉(zhuǎn)化酶催化的蔗糖水解反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。他們改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)條件，克服了Henri實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)，采取了如下的措施：1.控制水溶液的pH，使用了pH4.5的醋酸buffer;2.考慮了產(chǎn)物的變旋影響，使用NaOH終止反應(yīng)，加速產(chǎn)物的變旋作用。典型的實(shí)驗(yàn)曲線如Fig.1.1.1所示，F(xiàn)ig.1.1.1蔗糖反應(yīng)轉(zhuǎn)化酶催化的蔗糖水解反應(yīng)的時(shí)間過(guò)程最大底物濃度為0.333M;最小底物濃度為0.0052M;曲線1,2,3,…….代表不同的底物濃度；Δα:產(chǎn)物完成變旋后反應(yīng)混合物旋光度的變化。產(chǎn)物：Glucoseandfructose.。Henri在他的實(shí)驗(yàn)中測(cè)量的是反應(yīng)速度常數(shù)，而MichaelisandMeten建議利用反應(yīng)初速度作為反應(yīng)速度的一種測(cè)量。測(cè)量反應(yīng)初速度的優(yōu)點(diǎn)在于可以消除產(chǎn)物可能產(chǎn)生的抑制作用以及在反應(yīng)進(jìn)行期間酶的鈍化?；谂cHenri機(jī)制II相同的圖示，（1.1.14)

M-Menten利用與Henri使用的基本相同的方法得到了一個(gè)速度方程。推導(dǎo)如下：假定E和S的結(jié)合是處于快速平衡，即則ES的解離常數(shù)（1.1.15)

迅速地建立起來(lái)，以致于ESE+P并不影響這一平衡。而由ES到產(chǎn)物生成這一步是反應(yīng)的限速步驟。解離常數(shù)Ks的倒數(shù)可以作為酶對(duì)底物的一種測(cè)量。然而，應(yīng)該指出，快速平衡法的基本假定有時(shí)不能成立，因?yàn)橛械姆磻?yīng)E+SES是不成立的。后來(lái)，穩(wěn)臺(tái)法對(duì)這一點(diǎn)做了改進(jìn)。三.Brigg和Haldane的工作在H-M-M法中，假定中的k-1>>k+2，這是一種特殊的限制。1925年Brigg和Haldane對(duì)-M-M法做了改進(jìn)，他們?cè)谕茖?dǎo)速度方程時(shí)把k-1>>k+2這一假定取消了。他們的方法就是現(xiàn)在大家熟知的穩(wěn)態(tài)法或稱為穩(wěn)態(tài)近似。在酶反應(yīng)的過(guò)程中，中間產(chǎn)物ES一直穩(wěn)定存在。ES的濃度變化可用下式表示d[ES]/dt=k+1[E][S]–(k-1+k+2)[ES](1.1.19)

在反應(yīng)剛開(kāi)始時(shí)，我們可以近似地認(rèn)為反應(yīng)速度ν=k+2[ES]是不變的，因?yàn)閇ES]也不變。換句話說(shuō)，d[ES]/dt與反應(yīng)的總速度比較起來(lái)可以忽略不計(jì)。故有d[ES]/dt=0則1.1.19式變成k+1[E][S]–(k-1+k+2)[ES]=0（1.1.20)這個(gè)式子代替了迅速平衡法中的1.1.15式(Ks=[E][S]/[ES])。利用物種守恒e0=[E]0=[E]+[ES]（1.1.21)由（1.1.20)和（1.1.21)式得到ES復(fù)合物表達(dá)式

（1.1.22)將（1.1.22)代入速度方程ν=k+2[ES],則

（1.1.23)

在該法中唯一的假定是d[ES]/dt=0,取消了快速平衡法中的兩個(gè)假定這意味著穩(wěn)態(tài)法較快速平衡法優(yōu)越。容易看出（1.1.18)式為（1.1.23)式的特例，即當(dāng)k-1>>k+2時(shí)，（1.1.23)式變成了（1.1.18)式。第二節(jié)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法一.速度參數(shù)(Rateparameters)由H-M-M酶反應(yīng)機(jī)制導(dǎo)出的速度方程有下面的形式快速平衡限速步驟如果定義兩個(gè)變量x和y，x=α+sy=βe0–ν（1.2.2)那么，(1.2.1)式可以變成如下形式，xy=αβe0

這是矩形雙曲線，極值為V=βe0

與e0呈正比。常數(shù)α為當(dāng)ν=?V時(shí)，所對(duì)應(yīng)的底物濃度，成為Michaelis常數(shù)，用Km值表示。β=V/e0表示單位時(shí)間內(nèi)一個(gè)酶分子可以轉(zhuǎn)化的底物分子數(shù)，稱為分子活力（Molecularactivity),用k0表示。對(duì)于寡聚酶來(lái)說(shuō)，常使用催化中心活力的術(shù)語(yǔ)，即單位時(shí)間內(nèi)酶分子中每個(gè)催化中心所能轉(zhuǎn)化的底物分子數(shù)，用kcat（CatalyticcenterActivity)表示。Kcat=k0/n。有時(shí)，把分子活力或催化中心活力叫轉(zhuǎn)化數(shù)（turnovernumber)。這些在實(shí)驗(yàn)上可以測(cè)得的參數(shù)是進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析的基本常數(shù)，通常成為速度參數(shù)或動(dòng)力學(xué)常數(shù)，包括Km,k0(orkcat)。現(xiàn)在，我們用Km,V,k0(orkcat)代替速度方程中的α和，那么速度方程有如下形式（1.2.3)對(duì)大多數(shù)酶反應(yīng)來(lái)說(shuō)，速度方程有如（1.2.3)式的形式，但也有例外，變構(gòu)酶，反應(yīng)速度對(duì)底物濃度關(guān)系為s型曲線，而非雙曲線。應(yīng)該指出，在實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的速度參數(shù)或動(dòng)力學(xué)常數(shù)是表觀的，它們的真實(shí)物理意義并不清楚。僅當(dāng)我們把經(jīng)驗(yàn)的速度方程（empiricalRateequation)與由假定的機(jī)制推導(dǎo)的力學(xué)方程（mechanisticrateEquation)相比較時(shí)，這些參數(shù)如Km和k0（empiricalconstants)，它們的物理意義才清楚：

empiricalrateequation（1.1.18)

由快速平衡法推導(dǎo)的方程（1.2.3)k0=k=2是ES復(fù)合物分解成產(chǎn)物的速度常數(shù)；Km=Ks是ES復(fù)合物解l離常數(shù)。比較（1.1.18)和（1.1.23)兩式，empiricalrateequation（1.1.18)

由穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)的方程（1.1.23)可以得到三種不同形式的速度方程，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以求出Km和Vmax。其中，涉及三種作圖法，即1.Lineweaver-Burk作圖法（或雙倒數(shù)作圖法）；2.Woolf或Hofstee作圖法;3.Eadie作圖法。利用這些作圖法可以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論曲線（ν=Vs/(Km+s))的情況（見(jiàn)Fig.1.2.1)。Fig.1.2.1三種作圖法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論曲線擬合情況Lineweaver-Burk作圖法;(b)Woolf

或Hofstee作圖法;(c)Eadie作圖法。各種作圖法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。不過(guò)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)觀點(diǎn)（點(diǎn)的分布）來(lái)看S/ν對(duì)s圖是σο三種作圖法中最好的一種，但人們已習(xí)慣用雙倒數(shù)作圖法。三.進(jìn)行酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的基本程序和步驟

在文獻(xiàn)中，已經(jīng)發(fā)表了不少?gòu)母黝惷阜磻?yīng)機(jī)制推導(dǎo)出的速度方程，但不少人可能不太熟悉推導(dǎo)這些方程的基本程序和步驟。

1.推導(dǎo)速度方程的基本程序

首先，寫(xiě)出代表一個(gè)反應(yīng)的機(jī)制的示意圖如

然后，由示意圖出發(fā)推導(dǎo)速度方程。速度方程應(yīng)包括物質(zhì)濃度（如e0和s）和速度常數(shù)。在速度方程中，反應(yīng)速度是對(duì)其產(chǎn)生影響的物質(zhì)濃度和速度常數(shù)的函數(shù)。e0和s是實(shí)驗(yàn)中可測(cè)量的量。通常，在速度方程中，不包括游離酶的濃度，因其在實(shí)驗(yàn)中不易測(cè)得到。

2.影響酶反應(yīng)速度的物質(zhì)（1）催化劑（酶），反應(yīng)后復(fù)原；（2）底物和產(chǎn)物，經(jīng)歷化學(xué)變化；（3）效應(yīng)劑，能與酶分子按計(jì)量結(jié)合，而又不發(fā)生任何化學(xué)變化來(lái)影響反應(yīng)速度。3.在文章中如何討論酶反應(yīng)機(jī)制如果所提出的一種酶反應(yīng)機(jī)制不能解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果的話，那么可以說(shuō)所提出的反應(yīng)機(jī)制是不正確的。另一方面，應(yīng)該注意，即使由某一機(jī)制推導(dǎo)的速度方程與實(shí)驗(yàn)上得到的數(shù)據(jù)相符，也不能肯定地說(shuō)這一機(jī)制是正確的。例如Henri機(jī)制I盡管由它推導(dǎo)的速度方程在形式上與由Henri機(jī)制II推導(dǎo)出的一樣，也不能說(shuō)Henri機(jī)制I是正確的。除非我們能夠證明沒(méi)有任何其他機(jī)制可以解釋實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，否則我們還是不能說(shuō)，這個(gè)機(jī)制就是正確的。在處理動(dòng)力學(xué)文章中，常常看到如下說(shuō)法“結(jié)果與機(jī)制相符┈”，“結(jié)果與機(jī)制相符┈”，“結(jié)果可以根據(jù)這一機(jī)制來(lái)解釋。”“解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最小可能機(jī)制是┈”等。（2）內(nèi)部結(jié)構(gòu)因子：a.底物與效應(yīng)劑的分子結(jié)構(gòu)；b.酶分子結(jié)構(gòu)，包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、構(gòu)象（受溫度、壓力、pH和變性劑的影響），和物理狀態(tài)（如，固定化）。概括起來(lái)說(shuō)，影響酶反應(yīng)速度的因素有三類：濃度因素；外部因素（環(huán)境因素）； 內(nèi)部因素（結(jié)構(gòu)因素）。5.進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究的基本程序下面的框圖歸納了進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)研究的基本程序：Fig.1.2.2進(jìn)行酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的基本程序示意圖

作為一種定性的討論，我們做如下處理：當(dāng)?shù)孜餄舛缺让笣舛却筮^(guò)量時(shí)，即e0<<s0(s0>>e0

χ)，至少在反應(yīng)剛開(kāi)始時(shí)，p<<s,s是個(gè)常數(shù)，即ss0。改寫(xiě)1.3.2式dχ/dt=k+1（e0-χ）s0-（k-1+k+2）χ（1.3.6）

=k+1e0s0-[（k-1s0+（k-1+k+2）]χ=a-kχ其中，a=k+1e0s0

(1.3.7)k=k-1s0+（k-1+k+2）(1.3.8)解出微分方程11.6式,χ=(a/k)(1-e-kt)(1.3.9)1.3.9式表示ES復(fù)合物的時(shí)間過(guò)程,如Fig.1.3.1所示。Fig.1.3.1酶-底物復(fù)合物ES的時(shí)間過(guò)程曲線A代表S濃度不變的情況；曲線B代表真實(shí)情況曲線A表示[ES]復(fù)合物從零時(shí)以一級(jí)反應(yīng)（指數(shù)曲線）增加。當(dāng)t>>1/k

(因?yàn)閑-kt<<1)時(shí)，[ES]增至平臺(tái)值（a/k）。在平臺(tái)處，ES的形成速度f(wàn)=k+1es，等于它的分解速度b=（k-1+k+2）χ。此時(shí)，dχ/dt=0，

這是ES的穩(wěn)態(tài)。穩(wěn)態(tài)前的那一相，可以近似為一級(jí)過(guò)程，稱為預(yù)穩(wěn)態(tài)。曲線B表示反應(yīng)的真實(shí)情況。在上述處理中，我們假定底物濃度在反應(yīng)過(guò)程中不變。二.產(chǎn)物形成的時(shí)間過(guò)程

對(duì)1.3.5式積分，得到P=t0k+2χdt。產(chǎn)物的時(shí)間過(guò)程示于Fig.1.3.2中。圖中的曲線A和B分別代表當(dāng)[S]=常數(shù)和[S]隨時(shí)間減少的產(chǎn)物時(shí)間過(guò)程。Fig.1.3.2中反應(yīng)初相的遲滯部分相應(yīng)于ES的預(yù)穩(wěn)態(tài)。遲滯相的出現(xiàn)反映了主要中間體ES復(fù)合物的形成，即在酶分子上發(fā)生的變化。

Fig.1.3.2產(chǎn)物P的時(shí)間過(guò)程如果產(chǎn)物的形成不是經(jīng)過(guò)ES復(fù)合物，而是經(jīng)過(guò)E和S雙分子碰撞，情況會(huì)如何呢？我們從下述機(jī)制出發(fā)進(jìn)行討論，產(chǎn)物的微分方程有如下形式，

（1.3.12）對(duì)1.3.12式積分后得到的產(chǎn)物濃度時(shí)間關(guān)系用圖1.3.3表示。從圖中的曲線可以看出，反應(yīng)初相有一個(gè)“爆發(fā)”(曲線I)，而不是遲滯（曲線II）。原因在于，根據(jù)這一機(jī)制，產(chǎn)物形成的最大速度應(yīng)是[E]最大時(shí)，即反應(yīng)剛開(kāi)始時(shí)，因而觀察到一個(gè)“爆發(fā)”。上述例子清楚地說(shuō)明預(yù)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)如何可以區(qū)別導(dǎo)致相同穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)的不同機(jī)制。Fig.1.3.3產(chǎn)物在預(yù)穩(wěn)態(tài)的時(shí)間過(guò)程與反應(yīng)機(jī)制相關(guān)三.非穩(wěn)態(tài)（Non-Steady-State)如果So>>e0條件不成立，那么情況如何呢？Chance研究了過(guò)氧化物酶的預(yù)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)。在e0和S0濃度數(shù)量級(jí)相同時(shí)，微分方程1.3.13和1.3.14dx/dt=k+1e·s–(k–1_+k+2)x(1.3.13)dp/dt=k+2x(1.3.14)不能解析解出。這些方程的模擬解(analog)或數(shù)字解給出[EX]=x和[p]=p的時(shí)間過(guò)程。Fig.1.3.4過(guò)氧化物酶催化的反應(yīng)曲線(Stopped-flow)[ES]/uM[P]/uM很明顯，由Fig.1.3.4看不到反映[ES]形成的平臺(tái)。換句話說(shuō)，[ES]穩(wěn)態(tài)不再明顯出現(xiàn)。這種狀態(tài)被稱為非穩(wěn)態(tài)。預(yù)穩(wěn)態(tài)和非穩(wěn)態(tài)通常稱為酶反應(yīng)的瞬變相。四.瞬變相出現(xiàn)的時(shí)間范圍

由式χ=(a/k)(1-e-kt)可以估計(jì)預(yù)穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)的時(shí)間。假如ES達(dá)到它終值的90%，那么所需的時(shí)間t0.9可以由下面的推導(dǎo)而獲得。當(dāng)t=t0.9時(shí),有χ=0.9(a/k)=a/k(1-e-kt)