外加電場下菲降解細(xì)菌的生長、活性及菲的降解率,微生物論文

外加電場下菲降解細(xì)菌的生長、活性及菲的降解率,微生物論文多環(huán)芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是一類在環(huán)境中廣泛分布的有機(jī)污染物，其性質(zhì)穩(wěn)定、殘留時間長，是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的化學(xué)致癌物，已被多個國家列為優(yōu)先控制污染物。PAHs在環(huán)境中普遍存在，具有致誘變性，而且構(gòu)造穩(wěn)定，難以降解等特點。當(dāng)前，治理PAHs污染的方式方法主要以生物修復(fù)為技術(shù)。以微生物代謝作用為主的生物修復(fù)技術(shù)具有成本低、效果好、無二次污染等優(yōu)點，是當(dāng)前PAHs污染土壤修復(fù)最具有潛力的修復(fù)手段之一。但是采用傳統(tǒng)的微生物降解手段耗時較長，借助外加電場等技術(shù)加速菲的降解顯得尤為重要。對微生物細(xì)胞施加外加電場如弱電流在液相或泥漿體系中激發(fā)電極反響能刺激微生物的生長和代謝作用，已成功應(yīng)用于酵母菌的發(fā)酵、生物脫氮以及鐵細(xì)菌電化學(xué)培養(yǎng)等經(jīng)過。微生物電解技術(shù)是電化學(xué)與生物工程穿插領(lǐng)域的一個重要課題，近年來遭到研究者日益增長的關(guān)注。當(dāng)前該技術(shù)已在工業(yè)微生物培養(yǎng)和環(huán)境微生物電刺激修復(fù)兩方面顯示出良好的前景，為將來利用外加電場強化于微生物反響的生物化工及環(huán)境化工經(jīng)過提供了一個新的趨勢。鑒于此，筆者以從石油污染土壤分離得到的細(xì)菌Enterobacterdissolvens為實驗對象，以菲為唯一C源，由于菲在水中的溶解度較低，通過添加吐溫80促溶，使菲在水中的溶解度有明顯的提高。綜合考察在外加電場下，利用直流電(DC)和溝通電(IC)條件下，該細(xì)菌在生長、活性以及菲的降解率等方面的影響，旨在為利用微生物修復(fù)土壤環(huán)境中多環(huán)芳烴污染提供理論與實踐根據(jù)。1材料與方式方法1.1菌種來源所用的菌種挑選自天津大港油田油污染水中，并以菲為唯一C源進(jìn)行馴化。經(jīng)16srDNA測序后鑒定該菌為Enterobacterdissolvens屬革蘭氏陰性腸桿菌。1.2培養(yǎng)基采用無機(jī)鹽類(g/L):MgSO40.25、FeSO47H2O0.01、CaCl20.032、K2HPO40.8、KH2PO40.2、NH4NO30.8;由于菲難溶，故添加吐溫80作為增溶劑，質(zhì)量濃度分別為3.2和1000mg/L。1.3預(yù)培養(yǎng)條件參考Luo等報道電刺激多采用對數(shù)期的細(xì)菌作為研究對象，首先對細(xì)菌溶液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以保持細(xì)菌液具有較高的活性。預(yù)培養(yǎng)條件:首先從－80℃低溫冰箱中保存的甘油管中取出0.1mL種子菌液，接種至盛有50mL經(jīng)過濾滅菌含培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃恒溫?fù)u床(150r/min)中培養(yǎng)約10h，此時所得的細(xì)菌的生長處于對數(shù)生長期初期，菌體濃度(OD600)在0.2至0.3之間。1.4分析方式方法1.4.1細(xì)菌濃度測定測量600nm波長處的吸光度值(OD600)。1.4.2細(xì)胞脫氫酶活測定采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)顯色法測定細(xì)胞脫氫酶活。1.4.3氧化復(fù)原電位測定采用Pt4865-50-S7，氧化還原電極(MettlerToledo公司)測定氧化復(fù)原電位(ORP)。1.4.4菲的測定由于菲不溶于水，采用正己烷將溶液中的菲萃出。萃取出液相時，1mL樣品溶液中參加1mL正己烷，劇烈振蕩1min后離心，取上層有機(jī)相。采用ShimaduLC-10AT(Shimadu公司)高壓液相色譜配合C18反相柱測定有機(jī)相中菲的濃度。檢測方式方法為紫外法(UV)，檢測波長為254nm，流動相為甲醇-水溶液(兩者體積比為90∶10)，流速180mL/min。采用外標(biāo)法測定菲的濃度。1.4.5吐溫80的分析采用硫氫酸銨鈷顯色法測定吐溫80。1.5電解刺激實驗裝置及方式方法參照文獻(xiàn)［14］的方式方法進(jìn)行電刺激實驗。2結(jié)果與討論2.1外加電場對菲降解菌生長及代謝的影響脫氫酶是細(xì)胞胞內(nèi)呼吸鏈上一組重要酶系的統(tǒng)稱，其活性高低表示清楚了細(xì)胞從葡萄糖底物上獲取質(zhì)子和電子以供給細(xì)胞代謝活動的能力，也常用于表征微生物細(xì)胞的總體代謝活力，而且能直接表示生物細(xì)胞對其基質(zhì)降解能力的強弱。為考察直流電和溝通電對細(xì)菌E.dissolvens生長及活性的電解刺激效果，在實驗中采用測定細(xì)菌脫氫酶的方式方法來反映細(xì)菌的活性。為研究外加電場對E.dissolvens在生長和底物代謝兩方面的影響，在10mA電流條件下采用鉑電極分別對預(yù)培養(yǎng)菌液進(jìn)行了直流電和溝通電刺激，同時監(jiān)測實驗經(jīng)過中細(xì)胞脫氫酶活(DHA)、菲和吐溫80的降解速率以及生長曲線三方面的變化，結(jié)果如此圖1和圖2所示?！緢D1-2】由圖1可知:隨著加電時間的延長，細(xì)菌脫氫酶活性逐步加強，菌液中細(xì)胞的生長濃度也逐步增加。與參比值相比，能夠明顯看出加電后細(xì)菌的生長和脫氫酶活得到顯著提升。由圖2可知:加電后吐溫80和菲的濃度也有著顯著的變化。與參比值相比，2種C源的消耗均有所加快，尤其是在直流電條件下，吐溫80的降解速率較參比增長了1倍，在降解后的8h，DC刺激下的殘存余留菲的量為2.25，而對照組的殘存余留菲的量為2.68。很明顯在DC刺激下菲的降解速率是對照組的1.6倍。根據(jù)在無菌培養(yǎng)基中進(jìn)行電解的實驗結(jié)果，采用一樣條件下的10mA電流不會導(dǎo)致培養(yǎng)基中菲發(fā)生明顯的電化學(xué)降解(數(shù)據(jù)未顯示)。因而，綜合考慮細(xì)胞菌濃和脫氫酶活同時增長的實驗現(xiàn)象，加電菌液中菲的生物降解速率得到加快。此結(jié)果與筆者在以葡萄糖為唯一底物的培養(yǎng)基體系中的電解實驗類似。這表示清楚電解刺激方式方法確實能夠強化細(xì)胞對底物的代謝，而在外表活性劑-多環(huán)芳烴的生物修復(fù)體系中具有應(yīng)用潛力。2.2外加電場對培養(yǎng)液理化性質(zhì)的影響為了考察加電電場(ORV)對細(xì)胞菌液理化性質(zhì)的影響，因而測定了細(xì)菌溶液的氧化復(fù)原電位(ORP)值和pH，結(jié)果見圖3?！緢D3】由圖3可知:菌液的理化性質(zhì)隨著外加電場的施加，溶液的氧化復(fù)原電位急劇下降，尤其是直流電在加電的1h就到達(dá)－580mV，溝通電刺激后為－230mV，而參比值僅為100mV，并在整個培養(yǎng)周期內(nèi)顯著低于參照菌液。由圖3能夠看出:溶液的pH隨著細(xì)胞的生長代謝逐步下降，原因可能是在細(xì)胞生長的后期菌液出現(xiàn)一定程度的酸化現(xiàn)象。而加電后溶液的pH略低于參比值，并且在整個加電經(jīng)過中pH的變化很小。這一結(jié)果與佘鵬等、許曉路等對以葡萄糖為唯一C源的培養(yǎng)物體系的電解刺激作用結(jié)果類似，加電后細(xì)胞的脫氫酶活、底物降解及細(xì)胞的生長顯著提高。在菌液物化性質(zhì)上，加電后菌液的氧化復(fù)原電位明顯下降。這極有可能是陰極水電解反響所生產(chǎn)的H2導(dǎo)致了溶液氧化復(fù)原電位的急劇下降。這正是菌液中長期保持有氧狀態(tài)的強復(fù)原性環(huán)境的原因，進(jìn)而促進(jìn)了菲降解菌的生長和代謝。3結(jié)論研究表示清楚，外加電場對菲的降解有明顯的促進(jìn)作用。低電流刺激下，施加直流電能促進(jìn)菲降解細(xì)菌的生長和代謝，對菲的降解效果明顯。溝通電的刺激效果沒有直流電的刺激效果明顯，可能是直流電和溝通電電極反響產(chǎn)物的不同所造成的。因而，用微生物電解刺激降解多環(huán)芳烴污染是一種綠色可行的環(huán)保方式方法。電刺激技術(shù)是一個很復(fù)雜的體系，但是這一結(jié)果有助于加深對微生物電解刺激技術(shù)的認(rèn)識，為以后的應(yīng)用提供廣闊的前景。以下為參考文獻(xiàn):［1］何麗娟，李正華，洪青，等．一株菲降解菌的特性及相關(guān)降解基因的克?。跩］．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2018，15(5):682-685．［2］楊秀虹，湯婉環(huán)，李適宇．一株菲降解菌的生長特性及其對熒蒽和芘的降解能力［J］．中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2020，51(l):107-121．［3］劉其友，盧磊，趙東風(fēng)，等．一株菲降解茵的分離鑒定及其降解條件研究［J］．生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2018，19(11):2652-2656．［4］馬建偉，王慧，羅啟仕．電動力學(xué)作用下土壤中菲的遷移特