第四章目基因制取

第四章目基因制取第一頁，共87頁。挑出所要群落得到純系轉(zhuǎn)殖菌株大量培養(yǎng)生產(chǎn)人類胰島素HumanInsulin探針

Probe互補

DNA專一性抗體送入宿主細菌基因接入載體目標基因剪接Stryer(1995)Biochemistry,p.119Kleismith&Kish(1995)CellandMolecularBiology,p.115第二頁，共87頁。目的基因你所感興趣和想研究的基因，稱為目的基因。研究某個基因，或者要克隆某個基因用于生產(chǎn)大量DNA和蛋白質(zhì)分子，首先都要把它從龐大的基因組中分離出來。

第三頁，共87頁。目的基因需要克隆的DNA片段。編碼某種蛋白質(zhì)研究某基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究某基因與疾病的關(guān)系第四頁，共87頁。目的基因的克隆戰(zhàn)略一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克隆；另一類是利用PCR擴增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。第五頁，共87頁。第四章目的基因的制取一目的基因制取的基本策略二文庫法三化學(xué)合成法四PCR法第六頁，共87頁。一、目的基因制取的基本策略1.選擇含目的基因的實驗材料染色體DNA由mRNA反轉(zhuǎn)錄而得到的cDNA2.選擇合適的方法制備DNA片段并克隆到分子克隆載體3.人工構(gòu)建的重組體向寄主細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移4.選擇合適方法篩選目的基因第七頁，共87頁。真核基因克隆的基本步驟第八頁，共87頁。二文庫法制取目的基因

隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段或cDNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。第九頁，共87頁。組織或細胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合（一）從基因組DNA文庫獲取目的基因第十頁，共87頁。1.染色體DNA的切斷超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端。全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控第十一頁，共87頁。DNA的限制酶切

基因組DNA的片段化

a.不同的限制酶酶切基因組產(chǎn)生不同長度的片段第十二頁，共87頁。第十三頁，共87頁。第十四頁，共87頁。Four-baseenzymeSix-baseenzymeEight-baseenzymeb.不同的限制酶酶切同一個基因組產(chǎn)生不同數(shù)目的DNA片段第十五頁，共87頁。限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫第十六頁，共87頁。載體DNA的酶切：1.載體DNA用相應(yīng)的限制酶酶切2.載體DNA的脫磷酸化反應(yīng)

第十七頁，共87頁。去除載體DNA片段的5‘-末端磷酸基。防止線狀DNA自身環(huán)化(selfligation)。與在不同的分子上的兩個粘性末端相比較而言，同一個分子上的粘性末端更容易配對，因此載體自身環(huán)化的可能性最大。第十八頁，共87頁。用磷酸酶（如CIP，小牛腸內(nèi)磷酸酶）去掉載體上的磷酸基團。DNA連接酶需要在連接位點上有一個5’端的磷酸基。必須在連接反應(yīng)之前去掉磷酸酶，否則它也會把要插入的DNA的磷酸基團去掉，這造成連接失??！凝膠純化不會把載體與磷酸酶分開，切出來的凝膠帶中總會有一些磷酸酶。加熱滅活磷酸酶。小牛腸內(nèi)磷酸酶（CIP）加熱反應(yīng)物到65℃度并保持10分鐘。第十九頁，共87頁。脫磷酸化后連接的產(chǎn)物將會怎樣？產(chǎn)物將留下一個切口，如果質(zhì)粒進入了細菌的話，細菌能夠修復(fù)這個切口。第二十頁，共87頁。為什么不選擇把插入物去磷酸化？載體會環(huán)化并將會給我們帶來一些不含插入物的且有氨芐抗性的轉(zhuǎn)化子。一個自身環(huán)化的插入物不會帶來麻煩。因為它不會產(chǎn)生氨芐抗性，而那些在轉(zhuǎn)化過程中獲得環(huán)化DNA的菌株將無法在氨芐平板上生長。第二十一頁，共87頁。2.片段與載體的連接形成重組DNA分子

相容性末端直接連接不匹配末端的連接第二十二頁，共87頁。非互補粘性末端DNA分子間的連接在一定的反應(yīng)條件下，用T4DNA連接酶仍然可以將平末端的DNA片段連接起來。具有非互補粘性末端的兩種DNA片段之間，經(jīng)過作用于單鏈DNA的S1核酸酶處理變成平末端之后，一樣也可以使用T4DNA連接酶進行連接。

第二十三頁，共87頁。外源DNA片段定向插入載體分子用兩種不同的限制酶同時消化一種特定的DNA分子，將會產(chǎn)生出具有兩種不同粘性末端的DNA片段。如果載體分子和待克隆的DNA分子，都是用同一對核酸內(nèi)切限制酶切割，那么載體分子和外源DNA片段將按一種取向退火形成重組DNA分子。第二十四頁，共87頁。外源DNA片段同載體分子的重組

考慮到下列三個因素：①實驗步驟要盡可能簡單易行；②連接形成的“接點”序列，應(yīng)能被一定的核酸內(nèi)切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；③對轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不發(fā)生干擾。第二十五頁，共87頁。3.重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞。第二十六頁，共87頁。4.篩選含有目的基因的目的重組子利用遺傳標記基因鑒定重組DNA菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）第二十七頁，共87頁。操作的改進使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。在連接前將DNA片段進行分級分離例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，切下相當于1.6-2.0kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，回收，與載體進行拼接凝膠DNA片段回收技術(shù)

第二十八頁，共87頁。（二）cDNA文庫利用純化的總mRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成互補的DNA即cDNA，再按上述構(gòu)建基因文庫的類似方法對cDNA片段進行克隆，由此獲得的克隆總稱為“cDNA”文庫。若提取的是某種特異的mRNA，而非總的mRNA，則由此構(gòu)成的克隆即為相應(yīng)于該種特異基因的cDNA克隆。第二十九頁，共87頁。cDNA文庫的特點1.基因特異性

來自結(jié)構(gòu)基因，僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表正在表達的基因的遺傳信息2.器官特異性

不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結(jié)構(gòu)基因的表達就具有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫也就不同。第三十頁，共87頁。3.代謝或發(fā)育特異性

處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結(jié)構(gòu)基因表達亦不相同。

4.不均勻性

在同一個cDNA文庫中，不同類型的cDNA分子的數(shù)目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉(zhuǎn)錄而來的。第三十一頁，共87頁。mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制從cDNA文庫獲取目的基因第三十二頁，共87頁。構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。（2）mRNA的分離純化①原理利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。②mRNA的分離純化Column（柱）分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。第三十三頁，共87頁。尿素-氯化鋰和異硫氰酸胍法。polyT親和層析法、密度梯度離心分級法、探針篩選法。1.RNA的提取RNA酶的降解RNA分子不穩(wěn)定RNA易遭降解由于核糖環(huán)上的2`－OH促使對磷酸二酯鍵的親水性攻擊。第三十四頁，共87頁。RNA分子結(jié)構(gòu)RNA抽提第三十五頁，共87頁。胍類化合物尿素氯化鋰Rnasin---RNA酶DEPC(焦碳酸二乙酯

)尿素-氯化鋰法、硫氰酸胍法異硫氰酸胍法：可裂解細胞，使RNA與蛋白質(zhì)分離，將RNA釋放到溶液中。加入苯酚、氯仿，可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）為RNA，有機層（黃色）為DNA和蛋白質(zhì)第三十六頁，共87頁。動植物總RNA提取-Trizol法用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。

Trizol試劑：含有苯酚、8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等物質(zhì)，能迅速破碎細胞并抑制核酸酶。能保持RNA的完整性。第三十七頁，共87頁。mRNA的分離純化mRNA只占總RNA的1%-5%。原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA中分離純化。方法：寡聚（dT）-纖維素柱層析法。第三十八頁，共87頁。polyT親和層析法AAAAAAAAAAAApolyTpolyTpolyT第三十九頁，共87頁。mRNA純化第四十頁，共87頁。第四十一頁，共87頁。密度梯度離心分級法總mRN樣本蔗糖氯化銫第四十二頁，共87頁。2、cDNA合成cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，有反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時需要引物引導(dǎo)，常用引物是oligodT。第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。第四十三頁，共87頁。2.從mRNA制備cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈第四十四頁，共87頁。cDNA的第一鏈合成反轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，合成DNA。與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。禽類成髓細胞瘤病毒（AMV)的反轉(zhuǎn)錄酶

一類能引起鳥類等動物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。其反轉(zhuǎn)錄酶由一個α亞基和一個β亞基組成，有二種酶活力。1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力。2）RNaseH酶活力，水解RNA-DNA雜種分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’兩個方向起外切酶作用。第四十五頁，共87頁。

引物1、OligodT引物2、隨機引物（六聚體寡核苷酸）這種非特異性引物可沿著mRNA多個位點結(jié)合3、特異性引物。反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTT第四十六頁，共87頁。在總的RNA中可作為具有mRNA的特異引物文庫不能完全包含基因編碼序列產(chǎn)生一個大的具有特定序列的cDNA文庫cDNA產(chǎn)物可能是小的，不具有多聚腺苷的模板也可被利用可產(chǎn)生大量特定基因的cDNA文庫產(chǎn)生的cDNA文庫應(yīng)用范圍有限第四十七頁，共87頁。第二鏈合成剩下的cDNA單鏈的3’末端可能形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’

cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

第四十八頁，共87頁。用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉）。核酸酶S1cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

5’

3’

第四十九頁，共87頁。cDNA合成缺點：合成效率低;〈1%mRNA能合成cDNA。第五十頁，共87頁。第五十一頁，共87頁。

改進RNaseH酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNA聚合酶I能除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。第五十二頁，共87頁。mRNAcDNA3’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

5’

引物mRNAcDNA第一鏈3’

5’

mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’

RNaseHDNAligase去引物第五十三頁，共87頁?；蛑亟M反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3.cDNA文庫的組建第五十四頁，共87頁。cDNA末端修飾借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶第五十五頁，共87頁。加人工接頭第五十六頁，共87頁。cDNA克隆載體如果用功能測定來篩選目的基因，可用質(zhì)粒載體來構(gòu)建cDNA的表達文庫。如果通過分子雜交或抗體篩選目的基因，可用噬菌體載體構(gòu)建cDNA文庫。λ噬菌體載體－λZapcDNA載體

第五十七頁，共87頁。4.從cDNA文庫釣取目的基因第五十八頁，共87頁。cDNA文庫的篩選表達分析核酸原位雜交1、已知氨基酸序列的相關(guān)簡并密碼子探針；2、純化蛋白質(zhì)的相應(yīng)抗體探針；3、差異表達的扣除cDNA探針。第五十九頁，共87頁。1、簡并寡核苷酸探針簡并探針：是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。在探針庫中，只有一種與目的基因完全互補。一般為17個核苷酸，序列相同，堿基組成不同。雜交時借助一定濃度氯化四甲銨控制解鏈溫度（Tm)。第六十頁，共87頁。第六十一頁，共87頁。2、抗體探針利用免疫學(xué)的原理，檢測克隆基因的表達產(chǎn)物。第六十二頁，共87頁。

抗體鑒別陽性克隆用專門設(shè)計的表達載體，將真核基因編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中實現(xiàn)表達，通過免疫化學(xué)法進行檢測。第六十三頁，共87頁。第六十四頁，共87頁。差示雜交需要兩種不同的細胞群體（目的基因正常表達、目的基因不表達），分別制備兩種不同mRNA提取物，以兩種總mRNA探針（或以相應(yīng)的cDNA作探針)平行雜交，對有表達目的基因的細胞總mRNA構(gòu)建的克隆文庫進行篩選。第六十五頁，共87頁。差別雜交的局限性：

1.雜交靈敏度低，對于低峰度的mRNA尤為明顯。

2.工作量大，重復(fù)性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別，導(dǎo)致雜交信號不一致。第六十六頁，共87頁。DNA的化學(xué)合成寡核苷酸單鏈的化學(xué)合成探針的化學(xué)合成連接子和接頭的合成基因的半合成全長基因化學(xué)合成第六十七頁，共87頁。三化學(xué)法合成目的基因

DNA的化學(xué)合成法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酰胺法、氫磷酸法、寡核苷酸連接法等，現(xiàn)在常用的是固相亞磷酰胺法，使用全自動合成儀，將一個不同的單核苷酸按照需要連接起來再經(jīng)脫保護處理、純化，獲得一個特定的DNA片段。這種方法主要適用于已知核苷酸序列的、分子量較小的目的基因的制備。第六十八頁，共87頁。方法磷酸二酯法亞磷酸三酯法寡核苷酸連接法第六十九頁，共87頁。磷酸二酯法磷酸二酯法的基本原理：將二個分別在5′-或3′-末端帶有保護基的脫氧單核苷酸連接起來，形成一個帶有磷酸二酯鍵的脫氧二核苷酸。具5′保護的單核苷酸，便能夠通過它的3′-OH同另一個具有3′保護的單核苷酸的5′-P之間定向地形成一個二酯鍵第七十頁，共87頁。一端脫保護的二核苷酸分子，如帶5′保護的二核苷酸分子，又能夠同另一個帶3′-保護的單核苷酸分子進行第二次縮合反應(yīng)，形成一個三核甘酸分子。第七十一頁，共87頁。亞磷酸三酯法原理是將所要合成的寡聚核苷酸鏈的3′-末端先以3′-OH與一個不溶性載體，如多孔玻璃珠（CPG）連接，然后依次從3′-5′的方向?qū)⒑塑账釂误w加上去，所使用的核苷酸單體的活性官能團都是經(jīng)過保護的第七十二頁，共87頁。第七十三頁，共87頁。寡核苷酸連接法化學(xué)合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp，而絕大多基因的大小超過了這個范圍，因此，需要將寡核苷酸適當連接組裝成完整的基因。常用的基因組裝方法主要有種

第七十四頁，共87頁。第一種方法是帶上5’-磷酸基團寡聚核苷酸，與相應(yīng)的互補寡核苷酸片段退火，形成帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段，再用T4DNA連接酶將它們彼此連接成一個完整的基團或基團的一個大片段。第二種方法是將兩條具有互補3’末端的長的寡核苷酸片段彼此退火，所產(chǎn)生的單鏈DNA作為模板在大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相應(yīng)的互補鏈，所形成的雙鏈DNA片段，可經(jīng)處理插入適當?shù)妮d體上。第七十五頁，共87頁。第七十六頁，共87頁。化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列第七十七頁，共87頁。限制化學(xué)法合成基因的因素①已知序列且有應(yīng)用價值的基因很少，而植物來源的基因更少；②化學(xué)合成的寡核苷酸片段長度有限，經(jīng)基因組裝才能合成較大的目的基因，而這往往使基因制備難度加大；③化學(xué)基因合成相比之下比較昂貴。第七十八頁，共87頁。四、PCR制備目的基因（1）目的基因的直接克隆適當?shù)囊?，PCR基因擴增法可以產(chǎn)生μg級的特異的靶DNA片段，達到這種數(shù)量級的基因組DNA可以直