電鏡在細胞凋亡研究中的應(yīng)用

電鏡在細胞凋亡研究中的應(yīng)用第1頁/共52頁一、細胞凋亡概論1、細胞凋亡的概念細胞凋亡（Apoptosis)或稱程序性壞死（Programmedcelldeath,PCD)。它是不同于細胞壞死（necrosis)的另外一種死亡方式，它貫穿于生命始終。如：樹木的落葉，蝴蝶的變態(tài)……,細胞凋亡不僅參與正常成年組織細胞更新（如血細胞發(fā)生、衰老細胞清除）、成年生理器官內(nèi)分泌的調(diào)控（如子宮產(chǎn)后復舊）等重要的生第2頁/共52頁理過程，而且是胚胎發(fā)育、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟的重要調(diào)控機制。同時細胞凋亡與增殖的失衡是腫瘤發(fā)生的重要機制。細胞壞死是細胞突發(fā)性病理性的死亡或生理環(huán)境急聚變化（如高熱缺氧等）所致。由于細胞膜的直接破壞而引起大量胞外水、電解質(zhì)進入細胞內(nèi)，只是細胞穩(wěn)態(tài)失衡，造成細胞器特別是線粒體腫脹進而細胞破裂。如能及時去除引起細胞損傷的因素，上述早期反應(yīng)尚可逆轉(zhuǎn)。早期反應(yīng)包括細胞凋亡對機體的許多正常生理功能具有重要意義。第3頁/共52頁特征細胞凋亡細胞壞死誘導因素生理及弱刺激強烈刺激最初表現(xiàn)蛋白質(zhì)合成下降腫脹細胞數(shù)量單個細胞丟失成群細胞死亡細胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片細胞形狀細胞皺縮、斷裂溶解膜完整性保持到最后階段很早消失線粒體完整、自身吞噬腫脹染色質(zhì)致密、凝聚、邊緣化分解、稀疏、固縮細胞核早期固縮斷裂晚期破碎核生化改變DNA片斷化彌散性降解細胞器無明顯變化腫脹破裂胞內(nèi)容物無釋放釋放胞質(zhì)生化改變?nèi)苊阁w酶增多溶酶體解體基因DNA有控降解隨機降解大分子合成一般需要不需要基因控制有無自吞噬常見無潛伏期數(shù)小時無蛋白質(zhì)合成有無控制因素內(nèi)分泌毒素后果不引起炎癥反應(yīng)有炎癥反應(yīng)意義生理性死亡方式病理性死亡方式第4頁/共52頁第5頁/共52頁第6頁/共52頁第7頁/共52頁第8頁/共52頁2、、細胞凋亡與程序性壞死程序性壞死（Programmedcelldeath,PCD)最早是是由發(fā)育生物學家研究動物發(fā)育過程發(fā)現(xiàn)的，細胞凋亡是形態(tài)學概念而程序性壞死是功能性概念，程序性壞死主要由細胞凋亡所引起，程序性壞死僅存在于發(fā)育細胞中。與細胞凋亡的比較如下：特征細胞凋亡程序性壞死形態(tài)學細胞凝聚或破裂細胞凝聚或破裂膜的完整性能保持能保持線粒體不受影響自身吞噬染色質(zhì)有邊集致密自吞噬無常見潛伏期數(shù)分鐘至數(shù)小時數(shù)小時蛋白質(zhì)合成有有始發(fā)因素糖皮質(zhì)激素，生長因子撤除胚胎、變態(tài)發(fā)育典型細胞胸腺細胞胚胎神經(jīng)元控制因素激素內(nèi)分泌生化改變無溶酶體增多第9頁/共52頁3、細胞凋亡的形態(tài)學特征最早發(fā)生的改變是核異染色質(zhì)邊集，分布于核膜下。而后，核染色質(zhì)進一步濃集，核固縮，逐步分裂為碎片。與此同時，細胞之中的細胞器及基質(zhì)也發(fā)生濃縮,失去水分。凋亡細胞皺縮,但胞膜完整。最后，質(zhì)膜下陷，包裹核碎片及細胞質(zhì)形成多個凋亡下體（Apopoticbodies),凋亡小體外被質(zhì)膜，可含核碎片也可僅含胞質(zhì)成分。凋亡小體一般被巨噬細胞吞噬。凋亡的發(fā)生和發(fā)展可分為：信號傳遞、中央調(diào)控結(jié)構(gòu)改變?nèi)齻€階段：

第10頁/共52頁（1）、信號傳遞階段：誘導凋亡的細胞外因素與細胞表面的死亡受體結(jié)合，將信號傳入細胞內(nèi)。（2）、中央調(diào)控階段：傳入細胞的信號分子，激活半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶家族，引起一系列酶族級聯(lián)反應(yīng)。（3）、結(jié)構(gòu)改變階段：凋亡細胞出現(xiàn)前述超微結(jié)構(gòu)改變。第11頁/共52頁4、細胞凋亡的應(yīng)用前景細胞凋亡是多細胞生物體重要的生理機制，對維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要作用，但該機制一旦失活可導致各種疾病。應(yīng)該利用現(xiàn)代技術(shù)進一步深入探討細胞凋亡的機制及細胞凋亡療法。從目前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和前景來看，細胞凋亡研究有著廣闊的應(yīng)用前景。（1）探討疾病的發(fā)生機理現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)正常和腫瘤組織內(nèi)部均發(fā)生自發(fā)性細胞凋亡，而一旦凋亡受到抑制就會導致腫瘤，另一方面許多疾病的發(fā)生與細胞生理性死亡的速度加快有關(guān)，如再障等第12頁/共52頁（2）探討藥物及其他治療手段的機制以細胞凋亡為研究手段，探討藥物及其他治療手段的作用機制和耐藥性，尋找新的治療藥物和方法。（3）在分子水平實現(xiàn)人為調(diào)控細胞凋亡，達到治療疾病的目的通過深入研究細胞凋亡的發(fā)生機制及其基因調(diào)控，并進行相關(guān)基因的分離和克隆，有望人為地調(diào)控細胞凋亡，提高治療效果，預(yù)防疾病的發(fā)生。應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)（反義技術(shù)、基因?qū)爰夹g(shù)）從調(diào)控細胞凋亡角度探索防止神經(jīng)退化性疾病、艾滋病和腫瘤的有效措施，目前已有人在進行多方面嘗試。第13頁/共52頁二、細胞凋亡的研究方法

隨著細胞凋亡研究的日益發(fā)展，如何在體外對細胞凋亡進行檢測，以便于在科研和臨床醫(yī)療實踐中更好地利用細胞凋亡機制并建立有效的細胞凋亡檢測手段已成為當務(wù)之急。目前，有關(guān)細胞凋亡的實驗室檢測手段主要是從細胞凋亡的形態(tài)學和生物化學特征對其進行體外的定性和定量研究。細胞凋亡的研究方法很多。但在具體的凋亡研究中，不可能也不需要對每種方法進行嘗試，怎樣才能做到既能達到研究目的，又能減少不必要浪費和工作量，是每個研究者所要考慮的問題。第14頁/共52頁研究凋亡的方法大致可分為以下三類：１、根據(jù)方法的定量定性特性分為：（１）只能定性的方法：瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學（包括光鏡、電鏡）觀察等；（２）能進行定量或半定量的方法：流式（ＦＣＭ）、原為末端標記法、ＥＬＩＳＡ定量瓊脂糖凝膠電泳。2、根據(jù)是否能將凋亡和壞死區(qū)分：能區(qū)分包括瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學（包括光鏡、電鏡）及雙染色流式細胞儀。不能區(qū)分的包括原為末端標記法和單染色流式細胞儀。3、根據(jù)樣本來源選擇不同的方法：第15頁/共52頁細胞凋亡的形態(tài)學檢測

細胞凋亡本身是一個形態(tài)學概念，形態(tài)特別是細胞核的形態(tài)學變化是凋亡細胞最典型的特征，因此形態(tài)學不僅是判斷凋亡細胞的基本參數(shù)，而且也是鑒定凋亡細胞最可靠的方法。在凋亡形態(tài)鑒定的各種方法中，除流式細胞儀外，其他檢測手段均不能很好地對凋亡細胞做定量分析，而且費時、費力、重復性欠佳。但形態(tài)學觀察簡便、直觀，并可保存標本。其中電子顯微鏡以其高放大、高分辯為首選。

第16頁/共52頁三、電鏡在細胞凋亡研究中的應(yīng)用

在細胞凋亡發(fā)展過程中電子顯微鏡科觀察到一系列不同于細胞壞死的形態(tài)學變化。凋亡的共同特征時細胞體積的收縮，以細胞核的形態(tài)變化尤為突出，但并不引起炎癥反應(yīng)。電鏡下早期凋亡細胞體積縮小，失去細胞連接和一些特殊膜表面結(jié)構(gòu),如微絨毛的消失，異染色質(zhì)邊集，但質(zhì)膜及細胞內(nèi)膜依然完整。然后核體積進一步縮小，并可裂解唯一或數(shù)個致密體，與其相聯(lián)的細胞質(zhì)形成具有完整模型結(jié)構(gòu)的凋亡小體，隨之凋亡小體……第17頁/共52頁要獲得好的電鏡觀察結(jié)果和圖片除了實驗本身成功意外，電鏡樣品的處理、標本的制備及必需的超微結(jié)構(gòu)水平十分關(guān)鍵。因此，我要給大家介紹電鏡樣品處理和制備的相關(guān)內(nèi)容.第18頁/共52頁第一部分常規(guī)透射電鏡樣品制備技術(shù)超薄切片（ultrathin-section）制備過程示意圖：第19頁/共52頁第20頁/共52頁第21頁/共52頁第22頁/共52頁第23頁/共52頁第24頁/共52頁第25頁/共52頁二、常規(guī)游離細胞樣品處理方法：1、瓊脂離心管的制備：選優(yōu)質(zhì)瓊脂，用雙蒸水配成2%的濃度，加熱溶解。在一個10ml的錐形離心管放一個尖端細的棒芯（可用有機塑料桿自制），灌入溶化的瓊脂，凝固后抽出棒芯備用。2、取材固定方法（1）細胞收集:1x106，PBS洗一次，置離心管中離心10分鐘，800～1000轉(zhuǎn)/分。（2）用1.0MPBS5ml重懸5分鐘。（3）將細胞懸液吸入有瓊脂空槽的離心管中。（4）離心，800～1000轉(zhuǎn)/分10分鐘。（5）取出離心管內(nèi)的瓊脂，仔細切下尖草內(nèi)含細胞團的瓊脂塊。

第26頁/共52頁（6）將含細胞團瓊脂塊投入2.5%戊二醛固定，4℃保存。（7）用0.1MPBS清洗一次。（8）1%四氧化鋨后固定30～60分鐘。（9）進入常規(guī)程序。第27頁/共52頁SEM生物樣品制備的基本要求

（一）每一處理步驟及操作過程中，都應(yīng)注意防止對樣品的污染和損傷，使被觀察的樣品盡可能地保持原有的外貌及微細結(jié)構(gòu)。

(二）去除樣品內(nèi)的水份，以利于維持SEM的真空度和防止對鏡筒的污染。但在脫水和干燥處理時，要盡量減少和避免樣品體積變小，表面收縮變形等人工損傷。（三）降低樣品表面的電阻率，增加樣品的導電性能，以提高二次電子發(fā)射率，建立適當?shù)姆床詈蜏p少樣品的充放電效應(yīng)。（四）無論觀察組織細胞的表面或內(nèi)部微細構(gòu)造，都應(yīng)注意確認和保護樣品的觀察面。第28頁/共52頁

SEM生物樣品的制備的基本操作程序第29頁/共52頁第30頁/共52頁第31頁/共52頁第32頁/共52頁第33頁/共52頁第34頁/共52頁培養(yǎng)細胞：組織培養(yǎng)細胞如培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上，可倒去培養(yǎng)液，加入冷的戊二醛進行固定、清洗、1%鋨酸后固定、脫水和浸透。浸透以后用柔軟的皺紙輕輕吸干包埋液，用刀片將蓋玻片上的細胞刮下成團，放入膠囊的底部中心，再將膠囊注滿包埋液，在烤箱內(nèi)固化。有的細胞直接生長在培養(yǎng)瓶壁上，可先用0.1%的胰酶將細胞從瓶壁上分離下來，在離心管內(nèi)離心成塊（速度為1500～2000r/min，時間為10～15min），再進行固定，按常規(guī)方法制備。細胞樣品：第35頁/共52頁白細胞制樣：經(jīng)1%肝素抗凝的靜脈血4～5ml，放入塑料離心管內(nèi)，以1500r/min的速度離心15～20min，然后吸去表面血漿，可見淡黃色透明層，不要攪動，再沿著管壁緩緩加入戊二醛，置冰箱內(nèi)固定約30min，用一段彎曲的長針，輕輕取出透明層，切成約1mm3小塊，再用戊二醛進一步固定。隨后可按常規(guī)樣品制備方法制備。血小板制樣：取抗凝血約8～10ml，先低速離心抗凝血（400r/min，10min），得到富含血小板的血漿，把此血漿和預(yù)溫到37℃的0.1%戊二醛等量混合，置37℃孵箱內(nèi)半小時作輕微的表面固定。再以1500～2000r/min的速度離心10min，棄去上清液，把沉淀出的血小板用37℃的2.5%戊二醛在孵箱內(nèi)固定2小時，隨后步驟和常規(guī)制片相同。第36頁/共52頁⑵游離細胞樣品制備法：游離細胞（如血細胞、精子及其他組織培養(yǎng)細胞等）的SEM樣品制備，具有一定的特殊性，現(xiàn)僅就一般常用的方法及注意事項作一簡要介紹。