實(shí)驗(yàn)三偽狂犬病抗體檢測

實(shí)驗(yàn)三偽狂犬病抗體檢測第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)

將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，從而使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在。第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釫LISA的原理和類型掌握阻斷ELISA操作程序第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六二、實(shí)驗(yàn)原理抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；酶結(jié)合物催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，根據(jù)顏色的有無和深淺判定抗原抗體反應(yīng)的發(fā)生與否。第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六間接法（IndirectELISA）阻斷法（BlockELISA)雙抗體夾心法（SandwichELISA)競爭法（CompetitiveELISA)第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六（1）間接法測定抗體A.將抗原吸附于固相載體表面；B.加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合物;C.

加酶標(biāo)抗體；D.加底物。測定底物的降解量＝抗體量。第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六顯色間接ELISA第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六

（2）阻斷法測定抗體A.

將抗原吸附在固相載體表面;B.先加待檢血清（抗體）,形成抗原-抗體復(fù)合物;C.

再加酶標(biāo)單抗；D.加底物。第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六單抗血清？底物顯色阻斷ELISA第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六（3）雙抗體夾心法測定抗原A.將抗體吸附于固相表面;B.加待檢抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;C.加酶標(biāo)抗體;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。

第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六

（4）競爭法測定抗原A.抗體吸附在固相載體表面;B.同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待測抗原，競爭結(jié)合抗體；對照只加入酶標(biāo)抗原；C.加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀包被緩沖液：0.025MpH9.6碳酸鹽緩沖液豬偽狂犬病毒（PRV）——抗原樣品稀釋液：pH7.4PBS三、實(shí)驗(yàn)材料第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六陰性對照（EP管中，已稀釋）陽性對照（EP管中，已稀釋）樣品——待測豬血清（EP管中，已稀釋）AP標(biāo)記豬PRV單抗——酶標(biāo)單抗（EP管中，已稀釋）洗滌液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS（青瓶）第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六常用酶及底物常用酶底物反應(yīng)后顏色辣根過氧化物酶（HRP）鄰苯二胺（OPD）棕黃色堿性磷酸酶（AP）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）藍(lán)色第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六底物緩沖液：pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：TMB（四甲基聯(lián)苯胺），底物緩沖液，30%H2O2，新鮮配制終止液第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六1.抗原處理：2.抗原包被：取酶標(biāo)板，加入100μL/孔的抗原稀釋液4℃，18h取出包被好抗原的酶標(biāo)板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次四、實(shí)驗(yàn)方法第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六3.加待測血清：標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體100μL/孔1234陰性待測陽性待測4.加單抗：37℃，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次各孔加入酶標(biāo)單抗100μL/孔37℃，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光顯色，10min,加終止液1滴6.觀察結(jié)果第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六取稀釋好的被檢血清2份和陰、陽性對照血清，每孔加入100μl，置37℃溫育30分鐘。洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200μl，靜置3分鐘倒掉，再在吸水紙上拍干，重復(fù)3次。每孔加酶標(biāo)單抗100μl，置37℃溫育30分鐘。洗板：同步驟2。顯色與終止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混勻，室溫（18-25℃）避光顯色10分鐘后。終止：每孔加終止液1滴(50μl)（0.25%氫氟酸），終止反應(yīng)。10分鐘內(nèi)測定結(jié)果。采用波長630nm的酶標(biāo)儀測定OD值。結(jié)果判定：試驗(yàn)成立的條件是：陰性對照孔平均OD630值與陽性對照孔平均OD630值之差≥0.4。S=樣品孔OD630值，N=陰性對照孔OD630值如果S/N比值≤0.6，樣品判定為PRV抗體陽性;如果S/N比值≤0.7但>0.6，樣品可疑;如果S/N比值>0.7，樣品判定為PRV抗體陰性。第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六五、結(jié)果與分析陰陽性對照樣品的OD630＝?S/N＝?，被檢血清是陰/陽性？結(jié)果與預(yù)期的不符，可能的原因是什么？第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六預(yù)期結(jié)果陽性：無色陰性：藍(lán)色1234陽性陽性陰性被檢單抗血清？底物顯色被檢？？第20頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六ELISA前血清樣品37℃滅活30分鐘。在ELISA的整個(gè)操作過程中，洗滌是非常重要步驟，目的在于防止引起非特異性吸附，洗滌時(shí)盡可能除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，用力甩干。加入底物液后應(yīng)室溫避光，結(jié)果判斷