實驗室分區(qū)設(shè)置和要求演示文稿

實驗室分區(qū)設(shè)置和要求演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有28頁\編輯于星期五實驗室分區(qū)設(shè)置和要求現(xiàn)在是2頁\一共有28頁\編輯于星期五

在由中華人民共和國衛(wèi)生部辦公廳于2002年1月14日下發(fā)的《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文)附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設(shè)置標準》。設(shè)計根據(jù)現(xiàn)在是3頁\一共有28頁\編輯于星期五臨床PCR診斷實驗室設(shè)計方案工作流向?qū)Ｓ米呃犬a(chǎn)物分析區(qū)擴增區(qū)標本制備區(qū)試劑準備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向現(xiàn)在是4頁\一共有28頁\編輯于星期五錯誤的設(shè)計現(xiàn)在是5頁\一共有28頁\編輯于星期五臨床基因擴增檢驗實驗室四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)(簡稱擴增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染?，F(xiàn)在是6頁\一共有28頁\編輯于星期五在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服，以便于鑒別。此外，當工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。清潔方法不當也是污染發(fā)生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準備區(qū)至擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染?，F(xiàn)在是7頁\一共有28頁\編輯于星期五試劑準備區(qū)設(shè)置要求·

超凈工作臺或試劑配置箱·

試劑冰箱·

可調(diào)移液器一套（四支），·

配有帶濾芯（防止氣溶膠）及無RNase酶的吸嘴·

無粉的乳膠手套·

渦旋器·

專用工作服·

無菌離心管·現(xiàn)在是8頁\一共有28頁\編輯于星期五下述操作在該區(qū)進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。貯存試劑和用于標本制備的材料應(yīng)直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。現(xiàn)在是9頁\一共有28頁\編輯于星期五含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴增反應(yīng)數(shù)來決定。主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預(yù)試驗來檢查，評價結(jié)果必須有書面報告。對于"熱啟動"技術(shù)(在第一個高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施?，F(xiàn)在是10頁\一共有28頁\編輯于星期五嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。本工作區(qū)的實驗臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈(254nm波長)，在工作完成后調(diào)至實驗臺上60~90cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄?，F(xiàn)在是11頁\一共有28頁\編輯于星期五標本制備區(qū)設(shè)置要求·

生物安全柜·

樣本冰箱·

可調(diào)移液器一套（四支），·

帶濾芯（防止氣溶膠）及無RNase酶的吸嘴·

臺式微型離心機（最大RCF16000g，最小RCF12500g）；·

試管架（Sarstedt93.1428）·

無粉的乳膠手套·

渦旋器·

專用工作服·

無菌離心管·

加熱塊現(xiàn)在是12頁\一共有28頁\編輯于星期五下述操作在該區(qū)進行：臨床標本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序?，F(xiàn)在是13頁\一共有28頁\編輯于星期五用于RNA擴增檢測的樣本制備好以后，應(yīng)立即進行cDNA合成，因為cDNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標本制備區(qū)設(shè)置一個以上的溫育裝置。cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進行擴增發(fā)生污染的可能性降低。待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進行PCR擴增?，F(xiàn)在是14頁\一共有28頁\編輯于星期五擴增區(qū)設(shè)置要求·

CobasAmplicor·

NucliSensEasyQ·

LightCycler熒光定量PCR儀·

LightCyclerCapillaryReleaser·

專用工作服·

PCR擴增儀現(xiàn)在是15頁\一共有28頁\編輯于星期五下述工作在本區(qū)內(nèi)進行：DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。不能從本區(qū)再進入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出?，F(xiàn)在是16頁\一共有28頁\編輯于星期五為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。如有加樣則應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。打開預(yù)處理過的反應(yīng)混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄?，F(xiàn)在是17頁\一共有28頁\編輯于星期五產(chǎn)物分析區(qū)設(shè)置要求·

孵箱·

洗板機·

酶標儀·

數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)·

專用工作服現(xiàn)在是18頁\一共有28頁\編輯于星期五下述操作在本區(qū)內(nèi)進行：擴增片段的測定。核酸擴增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標記或非同位素標記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法等。目前國內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法?，F(xiàn)在是19頁\一共有28頁\編輯于星期五本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1mol/LHC1中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/LHCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實驗人員的安全防護。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性?，F(xiàn)在是20頁\一共有28頁\編輯于星期五分子生