影響免疫組化染色的因素及對策

影響免疫組化染色的因素及對策第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎和前提。由于免疫組化染色過程中存在很多步驟或環(huán)節(jié)，每一個步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的最終結(jié)果，因此，要做好一張高質(zhì)量的免疫組化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技術員和病理醫(yī)生密切配合、相互協(xié)調(diào)、共同努力才能保證做出合格的免疫組化切片。第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六一、影響免疫組化染色質(zhì)量的因素1、標本的固定手術標本的及時固定是保證免疫組化染色質(zhì)量的關鍵。未能及時固定的組織，會造成細胞的變性和自溶，導致結(jié)構(gòu)的破壞和抗原物質(zhì)的彌散，在免疫組化染色上表現(xiàn)為抗原定位的變化和背景染色的增高。過度的固定會造成抗原決定簇的封閉和抗原的丟失。第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六同一病例的ER表達情況ERER固定不及時固定二周后取材固定8小時后取材第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六未及時固定的乳腺癌組織ER表達胞漿著色第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六影響免疫組化染色質(zhì)量的因素2、切片質(zhì)量的影響切片太厚、皺褶，刀痕，敷貼不牢固，以及脫蠟不徹底，均會影響免疫組化的染色質(zhì)量，易出現(xiàn)非特異性染色和染色不均勻。第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六影響免疫組化染色質(zhì)量的因素3、抗原修復環(huán)節(jié)的影響抗原修復環(huán)節(jié)在免疫組化染色中是極為重要的環(huán)節(jié)。不同的修復時間、不同的修復方法、不同的抗原修復液，最終的結(jié)果會有差異。第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

同一蠟塊不同修復方式的結(jié)果ERHer-2(2+)Her-2(1+)微波修復水浴修復第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

同一蠟塊不同修復時間的結(jié)果第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

同一蠟塊使用不同修復液的結(jié)果Ki-67EDTA檸檬酸第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六4、操作過程中細節(jié)問題的影響滴加抗體未完全覆蓋組織，PBS殘留過多，操作過程中切片干燥等原因，會出現(xiàn)邊緣效應和染色不均勻及北京染色等。第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六抗體覆蓋組織不完全造成的邊緣效應第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六抗體覆蓋不均勻的灶狀著色第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六影響免疫組化染色質(zhì)量的因素5、第一抗體、檢測系統(tǒng)的影響使用不同克隆、不同種屬來源的抗體，不同的檢測系統(tǒng)，免疫組化的染色會產(chǎn)生差異。使用三步法試劑盒（如SP法）生物素系統(tǒng)進行免疫組化染色時，如果操作不當會產(chǎn)生較強的背景染色。第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六影響免疫組化染色質(zhì)量的因素6、顯色劑、復染劑的影響不同的DAB顯色試劑盒、不同的顯色時間，會對免疫組化染色強度及級別判斷產(chǎn)生影響。蘇木素復染過深、過淺，對比都不清晰。第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六DAB顯色恰當GST-π第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六DAB顯色恰當CK5/6第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六Ki-67第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六胸腔積液離心包埋細胞塊的免疫組化染色TTF-1CK7第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六Calponin第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六TOPOⅡ第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六CK5/6第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六P63第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六DAB顯色適當，蘇木素復染過淺第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六二、免疫組化染色的質(zhì)量控制組織固定1、標本在離體后應立即浸泡于相當于標本體積8~10倍的標準固定液中，大標本要剖開固定。離體后標本固定前存放不得超過30分鐘。2、在實際工作中，就可操作性而言，10%的緩沖福爾馬林是兼顧保存組織形態(tài)和抗原性通行的、被廣泛接受的選擇。3、適度、適時的固定。一般而言，大標本只要做到及時切開固定，在室溫下12小時即可達到固定要求；為了適應免疫組化染色標準化的需要，標本固定后應及時取材，通常固定時間不得超過24小時。4、達到固定時間要求而不能及時進入脫水程序的標本，建議將標本置入70%的乙醇中進行暫時保存直至進入組織脫水程序。第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六免疫組化染色的質(zhì)量控制脫水及制片1、建立嚴格的組織脫水試劑規(guī)范化更換制度，保證組織處理質(zhì)量。2、切片厚度一般3~4μm，厚薄均勻、平整，無刀痕、折疊，采用高質(zhì)量防脫載玻片。3、切片在60℃烤箱內(nèi)烤2~3小時，或者70℃烤箱內(nèi)1小時。4、脫蠟要和常規(guī)切片分開，使用單獨的二甲苯，如果溫度過低或二甲苯使用次數(shù)較多，可適當延長脫蠟時間。第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六免疫組化染色的質(zhì)量控制抗原修復抗原修復的方式有多種，熱修復一般推薦高壓鍋熱修復法，但是微波修復也有其方便的一面。影響抗原修復的基本因素是加熱的溫度和加熱的時間，以及所使用的修復液的PH值。需要操作者在實際工作中摸索總結(jié)，同時要根據(jù)每種抗體的具體要求，找到較適合的修復方式?？乖迯偷那‘斉c否，直接關系到免疫組織化學染色的成敗，進一步影響最后結(jié)果的正確判讀。第27頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六免疫組化染色的質(zhì)量控制抗體及檢測系統(tǒng)的選擇選擇優(yōu)良的抗體和檢測試劑盒，新買抗體要進行敏感性測試，找到最佳的抗原修復條件，每次試驗要設置相應的陽性和陰性對照。試劑的使用一定在其有效期內(nèi)，同時經(jīng)常觀察抗體使用過程中的結(jié)果變化，如不理想要及時更換。第28頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六免疫組化染色的質(zhì)量控制顯色和復染不要忽視顯色過程，和常規(guī)染色類似，顯色不恰當也會造成染色的前功盡棄。不同的組織、不同的抗體顯色時間有差異，必要時使用顯微鏡觀察切片的顯色效果。蘇木素復染過深過淺都會造成對比不清晰，不利于觀察評價。第29頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六免疫組化染色的質(zhì)量控制影響免疫組化染色的因素很多。在操作中應注重細節(jié)，避