RNA的生物合成轉(zhuǎn)錄

概述轉(zhuǎn)錄（transcription）：以DNA為模板合成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄的意義：基因表達(dá)的第一步，也是關(guān)鍵的一步。現(xiàn)在是1頁\一共有54頁\編輯于星期一基因(gene)：基因是負(fù)責(zé)編碼一個(gè)RNA的一段DNA序列。對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的基因，該RNA進(jìn)而編碼產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)。啟動(dòng)子（Promoter）：一段能夠被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的DNA序列，它決定著基因是否轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（Startpoint）：RNA轉(zhuǎn)錄合成起始處所對(duì)應(yīng)的DNA分子上的堿基對(duì)。用+1表示。上游（Upstream）和下游：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的5’-端，稱為上游，上游單核苷酸的位置用-10、-35等表示。而在其3’-端稱為下游，下游單核苷酸的位置用+10、+100等表示。終止子（Terminator）：一段能夠引起RNA聚合酶終止合成RNA的DNA序列。1.一些重要的概念現(xiàn)在是2頁\一共有54頁\編輯于星期一AtranscriptionunitisasequenceofDNAtranscribedintoasingleRNA,startingatthepromoterandendingattheterminator.現(xiàn)在是3頁\一共有54頁\編輯于星期一轉(zhuǎn)錄單位（transcriptionunit）：從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到終止位點(diǎn)的一段DNA，或能夠被轉(zhuǎn)錄成一個(gè)RNA分子的一段DNA，稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位可以包含1個(gè)或幾個(gè)基因。單順反子（monocistron）：一條mRNA只代表一個(gè)基因，稱為單順反子。多順反子（polycistron）：很多情況下，一個(gè)mRNA分子中含有多個(gè)基因，稱為多順反子。初始轉(zhuǎn)錄物（Primarytranscript—precursor)：剛剛轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生、未經(jīng)任何形式加工的RNA，稱為初始轉(zhuǎn)錄物?，F(xiàn)在是4頁\一共有54頁\編輯于星期一模板鏈（templatestrand）：DNA雙鏈中，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則指導(dǎo)合成RNA的一條鏈。又稱反義鏈。編碼鏈（Codingstrand）：

DNA雙鏈中，與模板鏈互補(bǔ)的另一條鏈，稱為編碼鏈。又稱有意義鏈?，F(xiàn)在是5頁\一共有54頁\編輯于星期一2.轉(zhuǎn)錄的一般特點(diǎn)

（1）以DNA為模板酶促合成RNA

細(xì)胞內(nèi)RNA的生物合成過程是一個(gè)酶促反應(yīng)過程，參與該過程的酶是RNA聚合酶（RNApolymerase）。此酶必須以雙鏈DNA中的一條鏈（或單鏈DNA）為模板，按照堿基配對(duì)原則，將NTP以3′,5′-磷酸二酯鍵的方式聚合起來，催化合成與模板互補(bǔ)的RNA。

（2）DNA雙鏈中只有一條鏈被轉(zhuǎn)錄成RNA—轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性。

（3）RNA的合成方向：5′→3′。

（4）轉(zhuǎn)錄的起始不需要引物，RNA聚合酶無校正功能。現(xiàn)在是6頁\一共有54頁\編輯于星期一3.轉(zhuǎn)錄過程

共包括4步：

1）Templaterecognition模板識(shí)別

2）Initiation起始

3）elongation延伸

4）Termination終止現(xiàn)在是7頁\一共有54頁\編輯于星期一Transcriptionhasfourstages,whichinvolvedifferenttypesofinteractionbetweenRNApolymeraseandDNA.TheenzymebindstothepromoterandmeltsDNA,remainsstationaryduringinitiation,movesalongthetemplateduringelongation,anddissociatesattermination.MCB1.識(shí)別2.起始3.延伸4.終止現(xiàn)在是8頁\一共有54頁\編輯于星期一4.轉(zhuǎn)錄的主要產(chǎn)物

messengerRNA(mRNA)transferRNA(tRNA)ribosomalRNA(rRNA)

AnmRNAistranslatedintoaproteinsequence;tRNAandrRNAprovideothercomponentsoftheapparatusforproteinsynthesis.現(xiàn)在是9頁\一共有54頁\編輯于星期一§5-2原核生物基因的轉(zhuǎn)錄1.RNA聚合酶（RNApolymerase）

以DNA為模板合成RNA的聚合酶。又稱為DNA依賴的RNA聚合酶。大腸桿菌RNA聚合酶：

全酶（holoenzyme）:α2ββ′σ

核心酶（coreenzyme）:

α2ββ′sigmafactor:theσpolypeptide.

σ因子能夠使細(xì)菌RNA聚合酶穩(wěn)定地結(jié)合在啟動(dòng)子上。只有全酶能夠起始轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在是10頁\一共有54頁\編輯于星期一Theαsubunitplaysaroleinpromoterrecognition.TheαsubunitalsoplaysaroleintheinteractionofRNApolymerasewithsomeregulatoryfactors.Theβandβ′subunitstogethermakeupthecatalyticcenter;TheβsubunitcanbecrosslinkedtothetemplateDNA,theproductRNA,andthesubstrateribonucleotides;SigmafactoristhesubunitofbacterialRNApolymeraseneededforinitiation;Itisthemajorinfluenceonselectionofbindingsites(promoters).現(xiàn)在是11頁\一共有54頁\編輯于星期一起始時(shí)RNA聚合酶結(jié)合在-55to+20區(qū).當(dāng)σ亞基脫離后核心酶向下游收縮至-30.當(dāng)核心酶向下游移動(dòng)一些堿基對(duì)后，形成延伸復(fù)合物，開始了RNA的合成?，F(xiàn)在是12頁\一共有54頁\編輯于星期一AsingletypeofRNApolymeraseappearstoberesponsibleforalmostallsynthesisofmRNA,andallrRNAandtRNA,inaeubacterium.由同一種RNA聚合酶合成所以的細(xì)菌RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。About7000RNApolymerasemoleculesarepresentinanE.colicell.Probably2000~5000enzymesaresynthesizingRNAatanyonetime,thenumberdependingonthegrowthconditions.每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)含有打印7000個(gè)RNA聚合酶分子。其中2000~5000個(gè)在工作，具體數(shù)量由生長(zhǎng)條件決定。a,b,andb’亞基的大小恒定，而δ亞基大小有較大的變化?，F(xiàn)在是13頁\一共有54頁\編輯于星期一現(xiàn)在是14頁\一共有54頁\編輯于星期一ControlsitesinDNAprovidebindingsitesforproteins;codingregionsareexpressedviathesynthesisofRNA.

2.PromoterandInitiation啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始

現(xiàn)在是15頁\一共有54頁\編輯于星期一1）原核生物基因的啟動(dòng)子有4個(gè)結(jié)構(gòu)特征Fourconservedfeaturesinabacterialpromoter:Startpoint轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn);-10sequence-10序列;-35sequence-35序列;-10and-35序列之間的間隔序列。

現(xiàn)在是16頁\一共有54頁\編輯于星期一startpoint轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)它通常是嘌呤單脫氧核苷酸(>90%)，其通用的核心序列是CAT,但該三聯(lián)體的保守性還不足以完全能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始。-10sequence

(Pribnowbox）其保守序列是

TATAAT（6bp），位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游-18to-9.現(xiàn)在是17頁\一共有54頁\編輯于星期一-35sequence（Sextamabox):核心序列是TTGACA.其中心位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約~35bp處。-10and-35序列之間的間隔序列：在90%的原核基因啟動(dòng)子中，長(zhǎng)為16-18bp，很少有小于15bp或大于20bp的.Althoughtheactualsequenceintheinterveningregionisunimportant,thedistanceiscriticalinholdingthetwositesattheappropriateseparationforthegeometryofRNApolymerase.盡管此間隔的序列不重要，但其長(zhǎng)短對(duì)于RNA聚合酶在空間上的準(zhǔn)確識(shí)別是重要的?，F(xiàn)在是18頁\一共有54頁\編輯于星期一在生物進(jìn)化過程中，形成了不同的σ因子。不同的σ因子可以幫助RNA聚合酶識(shí)別不同的啟動(dòng)子序列。

E.colisigmafactorsrecognizepromoterswithdifferentconsensussequences.(Numbersinthenameofafactorindicateitsmass.)現(xiàn)在是19頁\一共有54頁\編輯于星期一3.Elongation延伸RNA的合成—轉(zhuǎn)錄是在轉(zhuǎn)錄泡中進(jìn)行的。轉(zhuǎn)錄泡即暫時(shí)打開的DNA雙鏈（17bp），RNA聚合酶以其中的一條鏈—模板鏈為模板，按照堿基配對(duì)原則合成RNA。Transcriptiontakesplaceinabubble,inwhichRNAissynthesizedbybasepairingwithonestrandofDNAinthetransientlyunwoundregion.隨著轉(zhuǎn)錄泡的前移，后方的DNA重新形成雙鏈，將單鏈RNA釋放出去。Asthebubbleprogresses,theDNAduplexreformsbehindit,displacingtheRNAintheformofasinglepolynucleotidechain.

現(xiàn)在是20頁\一共有54頁\編輯于星期一Duringtranscription,thebubbleismaintainedwithinbacterialRNApolymerase,whichunwindsandrewindsDNA,maintainstheconditionsofthepartnerandtemplateDNAstrands,andsynthesizesRNA.現(xiàn)在是21頁\一共有54頁\編輯于星期一4.Termination終止Terminator

isasequenceofDNA,representedattheendofthetranscript,thatcausesRNApolymerasetoterminatetranscription.BacterialRNApolymerasehastwomodesoftermination.細(xì)菌RNA聚合酶的終止有兩種方式?，F(xiàn)在是22頁\一共有54頁\編輯于星期一根據(jù)RNA聚合酶的終止是否需要其他因子的參與，將終止子分為2種。

1）內(nèi)部終止子。不需要其他因子的幫助。Coreenzymecanterminateinvitroatcertainsitesintheabsenceofanyotherfactor.Thesesitesarecalledintrinsic（固有的，內(nèi)在的）terminators.

2）依賴于Rho(ρ)因子的終止子。ρ-dependentterminatorsaredefinedbytheneedforadditionofρfactorinvitro.

factorisanessentialproteininE.coli.Itfunctionssolelyatthestageoftermination.Itisa~275kDahexamerofidenticalsubunits.Itfunctionsasanancillary(輔助的)factorforRNApolymeraseIthasNTPaseactivity.現(xiàn)在是23頁\一共有54頁\編輯于星期一Intrinsicterminatorsincludepalindromicregionsthatformhairpinsvaryinginlengthfrom7-20bp.Thestem-loopstructureincludesaG-C-richregionandisfollowedbyarunofUresidues.Intrinsicterminators:現(xiàn)在是24頁\一共有54頁\編輯于星期一A-dependentterminatorhasasequencerichinCandpoorinGprecedingtheactualsite(s)oftermination.Rho-dependentterminators:現(xiàn)在是25頁\一共有54頁\編輯于星期一factorpursuesRNApolymerasealongtheRNAandcancauseterminationwhenitcatchestheenzymepausingata-dependentterminator.現(xiàn)在是26頁\一共有54頁\編輯于星期一§5-3

Transcriptionofeukaryoticorganism真核生物基因的轉(zhuǎn)錄

共有3類，分別由不同的RNA聚合酶復(fù)制。

1.RNApolymerase

RNApolymeraseI:rRNA(28S,18S,5.8S)

RNApolymeraseII:mRNA

RNApolymeraseIII:tRNAand5SrRNAandothersmallRNAs(snRNA).現(xiàn)在是27頁\一共有54頁\編輯于星期一Amajordistinctionbetweentheeukaryoticenzymesisdrawnfromtheirresponsetoα-amanitin

（α-鵝膏蕈堿）.

AmanitinisabicyclicoctapeptidederivedfromthepoisonousmushroomAmanitaphalloides;itinhibitstranscriptionbycertaineukaryoticRNApolymerases.鵝膏蕈堿是一種來自毒蘑菇的雙環(huán)八聚體蛋白，它能抑制RNA聚合酶的活性。現(xiàn)在是28頁\一共有54頁\編輯于星期一2.PromotersandTranscriptionalfactorsPromoter:

真核啟動(dòng)子可定義為位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所必需的序列。Transcriptionalfactors轉(zhuǎn)錄因子：識(shí)別并結(jié)合在啟動(dòng)子序列上的蛋白因子。PromoterelementsaredefinedbymutationsandfootprintingMutationsinthesitepreventfunctioninvitroorinvivo.

Proteinsthatactbybindingtoasitemaybefootprintedonit.現(xiàn)在是29頁\一共有54頁\編輯于星期一第二類RNA聚合酶的啟動(dòng)子：PromoterofRNApolymeraseII

:由兩部分組成：startpointandupstreamelements上游元件.

startpoint:傾向起始于A，其側(cè)翼序列為嘧啶堿基。一般形式為Py2CAPy5.

Atthestartpoint,thereisnoextensivehomologyofsequence,butthereisatendencyforthefirstbaseofmRNAtobeA,flankedoneithersidebypyrimidines.Theinitiator(Inr)thegeneralformPy2CAPy5.TheInriscontainedbetweenpositions-3and+5.現(xiàn)在是30頁\一共有54頁\編輯于星期一Upstreamelements:TATAbox:asacrucialpositioningcomponentofthecorepromotercontainsthesequenceTATAA/TAA/T.CAATbox:containsthesequenceGGC/TCAATCTplaysastrongroleindeterminingtheefficiencyofthepromoter.Itfunctionsineitherorientation.GCbox:containsthesequenceGGGCGG.Oftenmultiplecopiesarepresentinthepromoter,andtheyoccurineitherorientation.現(xiàn)在是31頁\一共有54頁\編輯于星期一Saturationmutagenesisoftheupstreamregionoftheb-globinpromoteridentifiesthreeshortregions(centeredat-30,-75,and-90)thatareneededtoinitiatetranscription.ThesecorrespondtotheTATA,CAAT,GCbox.現(xiàn)在是32頁\一共有54頁\編輯于星期一PromoterscontaindifferentcombinationsofTATAboxes,CAATboxes,GCboxes,andotherelements.現(xiàn)在是33頁\一共有54頁\編輯于星期一現(xiàn)在是34頁\一共有54頁\編輯于星期一轉(zhuǎn)錄因子（Transcriptionalfactors）:真核細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄需要大量的轉(zhuǎn)錄因子的參與。共有三類轉(zhuǎn)錄因子。ThenumberoffactorsthatcanactinconjunctionwithRNApolymeraseIIislarge.Wemaydividethemintothreegeneralgroups.

通用轉(zhuǎn)錄因子generalfactors上游轉(zhuǎn)錄因子upstreamfactors可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子induciblefactors現(xiàn)在是35頁\一共有54頁\編輯于星期一

除了啟動(dòng)子序列外，DNA分子中還有一種序列也與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)。這種序列能夠提高轉(zhuǎn)錄頻率，但它可能遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的上游或下游，這種序列叫增強(qiáng)子（enhancer）。增強(qiáng)子與啟動(dòng)子一樣，也是由不同的組件構(gòu)成的。增強(qiáng)子可以在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的基因中出現(xiàn)，也可以在RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄的基因中出現(xiàn)。Enhancerelementisacis-actingsequencethatincreasestheutilizationof(some)eukaryoticpromoters,andcanfunctionineitherorientationandinanylocation(upstreamordownstream)relativetothepromoter.

增強(qiáng)子Enhancer:現(xiàn)在是36頁\一共有54頁\編輯于星期一

AtypicalgenetranscribedbyRNApolymeraseIIhasapromoterthatextendsupstreamfromthesitewheretranscriptionisinitiated.Thepromotercontainsseveralshort(<10bp)sequenceelementsthatbindtranscriptionfactors,dispersedover>200bp.Anenhancercontainingamorecloselypackedarrayofelementsthatalsobindtranscriptionfactorsmaybelocatedseveralkbdistant.現(xiàn)在是37頁\一共有54頁\編輯于星期一§14-4轉(zhuǎn)錄后加工—加帽、加polyA尾和剪接Post-transcriptionalevents—Capping,PolyadenylationandSplicing1.Capping：Cap0:m7GpppX:單細(xì)胞真核生物，如酵母。Cap1:m7GpppXm：除單細(xì)胞真核生物外的其他真核生物。Cap2:m7GpppXmpYm：某些真核生物。現(xiàn)在是38頁\一共有54頁\編輯于星期一Capstructure：Thecapblocksthe5’endofmRNAandmaybemethylatedatseveralpositions.現(xiàn)在是39頁\一共有54頁\編輯于星期一加帽的功能FunctionofCap:ProtectionofthemRNAfromdegradation.防止mRNA被降解。EnhancementofthemRNA’stranslatability.增強(qiáng)mRNA的翻譯能力。TransportofthemRNAoutofthenucleus.有利于mRNA從核內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。Propersplicingofthepre-mRNA.有利于mRNA前體的正確剪接。現(xiàn)在是40頁\一共有54頁\編輯于星期一2.Polyadenylation聚腺苷酸化MosteukaryoticmRNAsandtheirprecursorshaveachainofAMPresiduesabout250nucleotideslongattheir3’-ends.Thispoly(A)isaddedpost-transcriptionallybypoly(A)polymerase聚腺苷酸化酶.Polyadenylationsignals加尾信號(hào):AAUAAA.Functions:Poly(A)enhancesboththelifetimeandtranslatabilityofmRNA.提高了mRNA的壽命和翻譯能力?，F(xiàn)在是41頁\一共有54頁\編輯于星期一現(xiàn)在是42頁\一共有54頁\編輯于星期一Poly(A)+RNAcanbeseparatedfromotherRNAsbyfractionationonSepharose-oligo(dT).現(xiàn)在是43頁\一共有54頁\編輯于星期一3.Splicing剪接Productsoftranscription:1)rRNAsplicing2)tRNAsplicing3)Nuclearpre-mRNA現(xiàn)在是44頁\一共有54頁\編輯于星期一含有內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄物中剪接區(qū)的堿基序列基因區(qū)域外顯子內(nèi)含子外顯子卵清蛋白內(nèi)含子2UAAGGUGAGC---------UUACAGGUUG卵清蛋白內(nèi)含子3UCAGGUACAG---------AUUCAGUCUGβ‐珠蛋白內(nèi)含子1GCAGGUUGGU---------CCUUAGGCUGβ‐珠蛋白內(nèi)含子2CAGGGUGAGU―――CCACAGUCUC免疫蛋白λ內(nèi)含子1UCAGGUCAGC―――UUGACGGGGCSV40病毒早期T-抗原UAAGGUAAAU―――UUUUAGAUUC1)真核生物基因內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)現(xiàn)在是45頁\一共有54頁\編輯于星期一真核生物基因內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.內(nèi)含子的大小:50～10000nt；2.5’-末端絕大多數(shù)為GU開始；3’-末端絕大多數(shù)為AG結(jié)束；3.在3’-末端的上游20～50nt處，有一段稱為分支點(diǎn)（branchsite）的序列，在酵母中，此序列幾乎都是UACUAAC，哺乳動(dòng)物中有多種不同的序列；4.在5’-末端、3’-末端及分支點(diǎn)保持不變的情況下，可在內(nèi)含子中插入不同大小的外源基因片段，而且不影響基因的加工?，F(xiàn)在是46頁\一共有54頁\編輯于星期一Theonlythreesequencesneededforsplicingare:shortconsensussequencesatthe5’and3’splicingsitesandatthebranchsite分支位點(diǎn).TheendsofnuclearintronsaredefinedbytheGT-AGrule.Splicingsignals剪接信號(hào)：現(xiàn)在是47頁\一共有54頁\編輯于星期一Thesplicingeventrequiresbreakageoftheexon-intronjunctionsandjoiningoftheendsoftheexons;MaturemRNAistransportedthroughnuclearporestothecytoplasm,whereitistranslated.

2)Nuclearpre-mRNA現(xiàn)在是48頁\一共有54頁\編輯于星期一3)剪接體催化的剪接機(jī)制（1）剪接體的定義在細(xì)胞核和胞質(zhì)溶膠中都含有多種不到300個(gè)核苷酸的小RNA分子，它們被稱為核內(nèi)小RNA（smallnuclearRNA，snRNA）和胞質(zhì)內(nèi)小RNA（smallcytplasmicRNA，scRNA）。這些RNA分子和特異的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成復(fù)合體，這些復(fù)合體分別叫做核內(nèi)小核糖核蛋白顆粒（smallnuclearribonucleoproteinparticles，snRNPs