RNA干擾技術(shù)基本原理與應(yīng)用

RNA干擾技術(shù)基本原理與應(yīng)用現(xiàn)在是1頁\一共有53頁\編輯于星期一什么是RNA干擾

RNA干擾(RNA

interference，RNAi),又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)，是指將特異性同源雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，使目的基因的不表達(dá)或表達(dá)水平下降.2001、2002年連續(xù)被Science評為年度十大成就!現(xiàn)在是2頁\一共有53頁\編輯于星期一目前應(yīng)用的基因干擾技術(shù)DNA水平的基因干擾技術(shù)基因敲除技術(shù)寡核苷酸與雙鏈DNA雜交采用多胺等小分子識別并阻遏特定轉(zhuǎn)錄因子現(xiàn)在是3頁\一共有53頁\編輯于星期一目前應(yīng)用的基因干擾技術(shù)mRNA水平的基因干擾技術(shù)用反義RNA技術(shù)阻遏翻譯過程,破壞內(nèi)源性mRNA設(shè)計寡核苷酸來破壞與mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì),使mRNA不穩(wěn)定雙鏈RNA干擾技術(shù)（RNAi）現(xiàn)在是4頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1984年,Jonathan研究小鼠L細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)反義mRNA會干擾同源基因的表達(dá)，機(jī)制不清1990年Jorgensen等矮牽牛顏色加深實驗

“共抑制(co-suppresion)”現(xiàn)在是5頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1995年SuGuo和KenEmphues反義RNA阻斷秀麗小桿線蟲par-1基因的表達(dá)實驗首次發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象1998年AndrewFire和CraigMello發(fā)現(xiàn)單鏈RNA抑制作用較弱，而純化的dsRNA可高效、特異地抑制基因的表達(dá)

Nature1998；391:806-11

正式提出RNA干擾的概念現(xiàn)在是6頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1999年Tuschl等報道在哺乳動物中也存在RNAi2001年Berstein等提出只有22核苷酸dsRNA才有特異性的阻斷效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)體內(nèi)分解dsRNA為siRNAs(short/smallinterferingRNA)的DICER酶現(xiàn)在是7頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程2002年Novina等用RNAi技術(shù)實現(xiàn)了對HIV-1病毒的阻抑2004年Morris等用RNAi技術(shù)實現(xiàn)了對人細(xì)胞基因的抑制

Science2004(August27)；305：1289-1292現(xiàn)在是8頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi的主要特點和優(yōu)勢誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默具有高度的特異性抑制基因表達(dá)的效率非常高可在不同細(xì)胞之間傳遞甚至傳到子代中去

“基因沉默系統(tǒng)化”現(xiàn)在是9頁\一共有53頁\編輯于星期一siRNA與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶

共同點特異性靶向性現(xiàn)在是10頁\一共有53頁\編輯于星期一siRNA與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶

不同點獨(dú)特的雙鏈結(jié)構(gòu)需要Dicer、RdRp、解旋酶、激酶等協(xié)同因子siRNA本身無催化活性在細(xì)胞內(nèi)可能具有相對的穩(wěn)定性具有一定的可遺傳性現(xiàn)在是11頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi的主要過程啟動階段dsRNA(500nt左右最佳)被Dicer酶特異性識別，以一種ATP依賴的方式逐步切割成siRNA長度：21-25nt結(jié)構(gòu)：3ˊ端懸垂兩個未配對的堿基UU現(xiàn)在是12頁\一共有53頁\編輯于星期一細(xì)胞中內(nèi)源性dsRNA的形成基因組中DNA反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物同時轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA病毒RNA復(fù)制中間體以單鏈RNA為模板由細(xì)胞或病毒的RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)催化合成dsRNA現(xiàn)在是13頁\一共有53頁\編輯于星期一Dicer酶RNAaseIII超家族成員。結(jié)構(gòu)中包括一個螺旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個RNA酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域，一個雙鏈RNA結(jié)合位點對單鏈RNA沒有活性對200~500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA廣泛存在現(xiàn)在是14頁\一共有53頁\編輯于星期一RdRp（RNAdependentRNApolymerase）使異常的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sRNA參與細(xì)胞內(nèi)dsRNA和siRNA的擴(kuò)增siRNA與靶mRNA的結(jié)合可激活RdRp，形成大量的dsRNA現(xiàn)在是15頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi的主要過程效應(yīng)階段RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的形成

siRNA、核酸內(nèi)切酶、外切酶和解旋酶RISC的激活：ATP依賴的解雙鏈過程在siRNA反義鏈的指導(dǎo)下，RISC特異性切割、降解靶mRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)失活現(xiàn)在是16頁\一共有53頁\編輯于星期一現(xiàn)在是17頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi技術(shù)的實驗方法siRNA的設(shè)計原則序列大小19-21nt，最好以A或G開始從mRNA的AUG開始，尋找AA二連序列，作為潛在的RNAi靶位點不要針對5‘和3’端非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTRs)

現(xiàn)在是18頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi技術(shù)的實驗方法siRNA的設(shè)計原則設(shè)計2~4個序列,BLAST比對基因序列以確保序列設(shè)計的特異性優(yōu)先選擇GC含量30-50%的序列設(shè)計適當(dāng)?shù)年幮詫φ招蛄鞋F(xiàn)在是19頁\一共有53頁\編輯于星期一陰性對照序列的設(shè)計特異性siRNA中的堿基進(jìn)行隨機(jī)排列，且行BLAST基因比對AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG

ATTCGTGCTCAATGCAATCG在特異性siRNA引入1~2個錯配堿基AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAGTTTAAATCCTAG現(xiàn)在是20頁\一共有53頁\編輯于星期一目標(biāo)序列篩選的相關(guān)網(wǎng)站/Stu/shilin/rnai.html/sirna.pl/rnai/http://RNAiD/rnaidesigner/:9331/RNAi/html/rnai.html

現(xiàn)在是21頁\一共有53頁\編輯于星期一查找已經(jīng)證實的siRNA的網(wǎng)站/catalog/category.aspx?key=49/techlib/tb/tb_502.html/mmcmanus/www/siRNADB.html/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published現(xiàn)在是22頁\一共有53頁\編輯于星期一siRNA的制備方法體外制備方法化學(xué)合成siRNA體外轉(zhuǎn)錄獲取siRNA利用Dicer或RNaseⅢ消化長的dsRNA成siRNA現(xiàn)在是23頁\一共有53頁\編輯于星期一化學(xué)合成法制備siRNA優(yōu)點：

純度高合成量不受限能被標(biāo)記缺點：價格昂貴、合成周期長用途：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究現(xiàn)在是24頁\一共有53頁\編輯于星期一體外轉(zhuǎn)錄法制備siRNA優(yōu)點：簡單成本低速度快毒性小穩(wěn)定性好

缺點：反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制用途：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs

現(xiàn)在是25頁\一共有53頁\編輯于星期一現(xiàn)在是26頁\一共有53頁\編輯于星期一消化法（“siRNAs雞尾酒”）優(yōu)點：無需檢測或篩選多個siRNA序列

產(chǎn)生多種siRNAs混合體，保證有效的目的基因沉默缺點：有可能引發(fā)非特異的基因沉默

用途：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個基因功能缺失的表型

現(xiàn)在是27頁\一共有53頁\編輯于星期一現(xiàn)在是28頁\一共有53頁\編輯于星期一siRNA的制備方法細(xì)胞內(nèi)制備方法依賴表達(dá)質(zhì)?；虿《据d體在細(xì)胞內(nèi)獲取siRNA通過PCR介導(dǎo)的siRNA表達(dá)試劑盒獲取siRNA現(xiàn)在是29頁\一共有53頁\編輯于星期一siRNA載體依賴RNA聚合酶III啟動子(polIII)，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。

人源U6啟動子鼠源的U6啟動子人H1啟動子polIII可在細(xì)胞中表達(dá)許多的小分子RNA，通過添加一串（3~6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈再克隆到載體中

現(xiàn)在是30頁\一共有53頁\編輯于星期一表達(dá)載體法制備siRNA優(yōu)點：可以進(jìn)行較長期研究。載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因達(dá)數(shù)星期或更久缺點：需要進(jìn)行克隆，周期長質(zhì)粒載體表達(dá)效率較低用途：唯一可以用于長期基因沉寂研究的方法現(xiàn)在是31頁\一共有53頁\編輯于星期一現(xiàn)在是32頁\一共有53頁\編輯于星期一基于PCR的siRNA表達(dá)框架(SECs)組成：RNApolIII啟動子發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNARNApolIII終止位點制備：PCR，無需克隆和測序現(xiàn)在是33頁\一共有53頁\編輯于星期一用SECs制備siRNA優(yōu)點：可直接由PCR得到，方法簡便，時間短在PCR片段兩端添加酶切位點，篩選出最有效的siRNA可用于構(gòu)建表達(dá)載體可以用來篩選特定研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配

現(xiàn)在是34頁\一共有53頁\編輯于星期一用表達(dá)框架制備siRNA缺點：PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中不能進(jìn)行序列測定，PCR和DNA合成時可能產(chǎn)生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想

用途：篩選siRNA序列在將siRNA克隆到載體前篩選最佳啟動子

現(xiàn)在是35頁\一共有53頁\編輯于星期一現(xiàn)在是36頁\一共有53頁\編輯于星期一現(xiàn)在是37頁\一共有53頁\編輯于星期一現(xiàn)在是38頁\一共有53頁\編輯于星期一shRNA(shorthairpinRNA)文庫

Nature2004；428：427-431(25March)針對：9,610humangenes5,563mousegenes構(gòu)建成：28,000個shRNA表達(dá)盒(cassettes)商品化試劑盒：ExpressionArrest?(美國冷泉港實驗室OpenBiosystems公司)

網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫中選擇特定的shRNA克隆，無需再耗時耗力進(jìn)行siRNA的設(shè)計、合成和驗證過程現(xiàn)在是39頁\一共有53頁\編輯于星期一CAM:氯霉素抗性基因hr：同源重組位點Barcode：每個shRNA獨(dú)特的識別序列MSCV：病毒載體骨架PKG-Puro：哺乳動物細(xì)胞中載體穩(wěn)定性的選擇Kan、oriT、RK6：逆轉(zhuǎn)錄病毒信號序列現(xiàn)在是40頁\一共有53頁\編輯于星期一siRNAshRNA使用代價高相對較低持久性最多2周可選擇獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞宿主類型細(xì)胞系原代細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞、細(xì)胞系設(shè)計復(fù)雜的設(shè)計方法完成獲取需要合成完成應(yīng)用瞬時轉(zhuǎn)染瞬時轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、病毒侵染檢測方法Western雜交、表型分析RT-PCR、芯片檢測Western雜交、表型分析、RT-PCR、芯片檢測研究領(lǐng)域細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)&體內(nèi)研究現(xiàn)在是41頁\一共有53頁\編輯于星期一現(xiàn)在是42頁\一共有53頁\編輯于星期一現(xiàn)在是43頁\一共有53頁\編輯于星期一現(xiàn)在是44頁\一共有53頁\編輯于星期一siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞.磷酸鈣共沉淀電穿孔法DEAE-葡聚糖和polybrene機(jī)械法：顯微注射和基因槍陽離子脂質(zhì)體試劑現(xiàn)在是45頁\一共有53頁\編輯于星期一提高轉(zhuǎn)染效率的方法純化的siRNA避免使用抗生素避免RNA酶污染較低傳代數(shù)的細(xì)胞合適的轉(zhuǎn)染試劑合適的陽性對照熒光標(biāo)記的siRNA現(xiàn)在是46頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi技術(shù)的應(yīng)用基因組功能研究的新方法研究信號傳導(dǎo)通路的新途徑開展基因治療的新策略（抗病毒、抗腫瘤等）篩選藥物靶點的新工具現(xiàn)在是47頁\一共有53頁\編輯于星期一RNAi技術(shù)抗病毒作用阻止病毒入侵、抑制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄自然界中普遍存在在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用RNA病毒：如HIV、HCV、脊髓灰質(zhì)炎病毒DNA病毒：如HBV現(xiàn)在是48頁\一共有53頁\編輯于星期