膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座專家講座

斜面培養(yǎng)物4支，營(yíng)養(yǎng)肉湯4支，生理鹽水2支，鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸水紙1本，載玻片4張。器材準(zhǔn)備膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第1頁(yè)染色瓶6組，染色架8個(gè)。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第2頁(yè)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)試驗(yàn)

綜合性試驗(yàn)一膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌檢測(cè)（四）斜面培養(yǎng)物觀察革蘭染色法肉湯接種法顯微鏡油鏡使用膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第3頁(yè)斜面培養(yǎng)物觀察從普通平板上挑取黃色或白色菌落接種斜面，菌苔顏色，還是原來(lái)菌落顏色，黃色或白色。從伊紅美藍(lán)平板上挑取紫黑色或粉紅色菌落接種斜面，菌苔已經(jīng)沒(méi)有原來(lái)菌落顏色。菌苔灰白色、表面濕潤(rùn)、光滑、不透明或半透明。為了講解方便，以后試驗(yàn)，依然沿用首次分離得到菌落顏色—紫黑或粉紅。從斜面上取菌時(shí)，普通只取半個(gè)小菌落大小菌量；接種環(huán)或接種針在培養(yǎng)基表面輕刮一下即可。

膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第4頁(yè)細(xì)菌染色法單染色法：只用一個(gè)染料染色，能清楚觀察菌體大小、形態(tài)與排列，不能判別細(xì)菌。復(fù)染色法（判別染色）：采取兩種以上不一樣染料進(jìn)行先后染色，可將細(xì)菌染成不一樣顏色，方便判別細(xì)菌?？顾崛旧?用于檢驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌等抗酸性細(xì)菌，陽(yáng)性者為紅色。特殊染色：莢膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，極體染色（用于白喉?xiàng)U菌異染顆粒染色）。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第5頁(yè)結(jié)核分枝桿菌抗酸染色麻風(fēng)分枝桿菌抗酸染色產(chǎn)氣莢膜梭菌莢膜Hiss染色破傷風(fēng)梭菌芽胞芽胞染色變形桿菌鞭毛Leifson染色

白喉棒狀桿菌異染顆粒Albert染色膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第6頁(yè)革蘭染色法GramStaining革蘭染色法是丹麥內(nèi)科醫(yī)生ChristainGram于1884年創(chuàng)建一個(gè)細(xì)菌染色方法，已經(jīng)有120多年歷史，仍在廣泛使用，是細(xì)菌學(xué)中最為經(jīng)典染色法。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第7頁(yè)革蘭染色法原理三種學(xué)說(shuō)通透性學(xué)說(shuō)：G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，酒精不易透入，反而可使細(xì)胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細(xì)胞外滲。G-菌細(xì)胞壁比較疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶紫—碘復(fù)合物輕易被酒精脫出。等電學(xué)說(shuō)：G+菌等電點(diǎn)(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，普通染色時(shí)染液酸堿度在pH7.0左右，電離后陽(yáng)性菌帶負(fù)電荷比陰性菌多，所以與帶正電荷結(jié)晶紫染料結(jié)合牢靠，不易脫色?；瘜W(xué)學(xué)說(shuō)：G+菌細(xì)胞內(nèi)含有某種特殊化學(xué)成份，普通認(rèn)為是核糖核酸鎂鹽與多糖復(fù)合物，它與染料—媒染劑復(fù)合物結(jié)合，使已著色細(xì)菌不易脫色。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第8頁(yè)革蘭染色意義判別細(xì)菌：把細(xì)菌分成G+和G-兩大類。選擇抗菌藥品：G+球菌對(duì)青霉素敏感,G-桿菌耐藥。了解細(xì)菌致病機(jī)理：G+菌大多產(chǎn)生外毒素,G-菌產(chǎn)生內(nèi)毒素。革蘭染色步驟涂片→干燥→固定→染色膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第9頁(yè)接種環(huán)取生理鹽水3～4ul，2滴。菌苔少許（1mm小菌落半量）與鹽水混勻，涂成＞1cm2。涂畢→環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂→接種環(huán)燒灼滅菌。涂片制備甲→黃色，紫黑。乙→白色，粉紅。丙→黃色，紫黑。丁→白色，粉紅?！?xì)菌適當(dāng)

↑細(xì)菌較多膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第10頁(yè)涂片干燥固定Fixation手持載玻片一端，涂膜朝上，兩個(gè)涂膜快速經(jīng)過(guò)火焰外層3次，時(shí)間2～3秒鐘。促使蛋白質(zhì)凝固，固定在載玻片上，以免染色水洗時(shí)候，細(xì)菌被水洗掉。

膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第11頁(yè)革蘭染色方法步驟涂片→干燥→固定→↓結(jié)晶紫→初染1分鐘→水洗→↓盧戈碘液→媒染1分鐘→水洗→↓95％乙醇→脫色約20秒鐘→水洗→↓稀釋復(fù)紅→復(fù)染1分鐘→水洗→↓吸干,鏡檢。★取菌適量,涂片均勻,水洗輕緩,脫色適當(dāng)。★影響革蘭染色關(guān)鍵步驟是涂片和脫色。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第12頁(yè)革蘭陽(yáng)性菌革蘭陰性菌膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第13頁(yè)G+鏈球菌G-雙球菌G+桿菌G+短桿菌G-弧菌G-螺菌膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第14頁(yè)液體培養(yǎng)基接種BrothTransfer—懸浮法SuspendingMethod甲→黃色,乙→白色,丙→紫黑,丁→粉紅。標(biāo)識(shí)：組號(hào)，顏色37℃培養(yǎng)4小時(shí)4～5×108cfu/ml①接種環(huán)斜面取菌，在靠近液面管壁上，上下研磨接種。②在管壁上，將接種環(huán)內(nèi)菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第15頁(yè)生物安全警告此次試驗(yàn)操作，可產(chǎn)生幾十至幾百個(gè)微生物氣溶膠顆粒。氣溶膠粒徑＞100um沉降很快,＜50um在0.4s內(nèi)擴(kuò)散開,＜5um經(jīng)過(guò)呼吸道直接抵達(dá)肺泡。Pike博士對(duì)試驗(yàn)室感染統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果發(fā)覺(jué)，不明原因感染高達(dá)82%，大多數(shù)是氣溶膠在空氣中擴(kuò)散引發(fā)。試驗(yàn)時(shí)應(yīng)坐著，在火焰周圍10～20厘米內(nèi)操作，保持平靜、有序，盡可能少說(shuō)話、少走動(dòng)，以免感染病原菌。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第16頁(yè)顯微鏡油鏡使用P1310×物鏡→看清楚標(biāo)本→滴加香柏油→100×油鏡→浸泡油中（幾乎與標(biāo)本接觸，工作距離0.13mm）→含糊物象→細(xì)調(diào)整調(diào)焦，觀察物像→統(tǒng)計(jì)結(jié)果→關(guān)閉電源。將聚光鏡調(diào)到最高處；孔徑光闌環(huán)上刻有物鏡倍率（10×，100×）必須轉(zhuǎn)到正面，與使用物鏡相對(duì)應(yīng)。油鏡處理：擦鏡紙拭去香柏油→擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。顯微鏡罩上防塵罩→橫放在試驗(yàn)柜內(nèi)?！?順德校區(qū)）試驗(yàn)臺(tái)兩側(cè)電源插座，只能插入一個(gè)插頭，請(qǐng)選擇離你最近電源插座?！铮ㄐ１静浚┰囼?yàn)臺(tái)中間，三個(gè)位插座，中間那位插孔沒(méi)有電，不能使用，只能用兩側(cè)插座。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第17頁(yè)100倍浸油物鏡使用方法油鏡放入光路之前，一定要在標(biāo)本觀察部位上加一滴浸油。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡進(jìn)入光路，用微調(diào)旋鈕對(duì)好焦距。假如浸油內(nèi)有氣泡，會(huì)影響觀察，可稍微旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡往返經(jīng)過(guò)1～2次浸油，排除油內(nèi)氣泡。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第18頁(yè)溫馨提醒因染色場(chǎng)地受限，1～5組先涂片染色，后接種肉湯。6～10組先接種肉湯，后涂片染色。待染色和肉湯接種完成，桌面收拾潔凈，才可鏡檢，以免污染。鏡檢過(guò)載玻片無(wú)須擦拭，直接投入玻片缸內(nèi)消毒、滅菌。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第19頁(yè)革蘭染色法P15甲→黃色，紫黑乙→黃色，紫黑丙→白色，粉紅丁→白色，粉紅肉湯接種法P10

甲→黃色乙→白色丙→紫黑丁→粉紅油鏡使用P13

10×物鏡→看到標(biāo)本→滴加香柏油→100×油鏡→浸泡油中→含糊物象→細(xì)調(diào)整調(diào)焦，觀察物像→統(tǒng)計(jì)結(jié)果→關(guān)閉電源→擦鏡紙拭去香柏油→擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。聚光鏡孔徑光闌環(huán)上物鏡倍率（10×或100×）必須轉(zhuǎn)到正面。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第20頁(yè)思索題革蘭染色法關(guān)鍵步驟是什么?為何?染色時(shí)為何通常要用新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物?怎樣使用油鏡?膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第21頁(yè)膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第22頁(yè)試驗(yàn)小結(jié)用普通平板，從濃汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細(xì)菌，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是經(jīng)典葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。葡萄球菌（電鏡）黃色、白色形態(tài)與染色（油鏡）酸葡萄黃色、白色菌落特征黃色白色膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第23頁(yè)葡萄球菌三個(gè)種判別試驗(yàn)金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血漿凝固酶+--甘露醇發(fā)酵+--新生霉素敏感性SSRA蛋白+--注：敏感（SensitiveS）,耐藥（ResistantR）。膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第24頁(yè)用伊紅美藍(lán)平板,從糞便標(biāo)本分離、取得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖致病菌。顯微鏡下，均為G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能判別是什么細(xì)菌。桿菌（電鏡）紫黑、粉紅細(xì)菌形態(tài)與染色（油鏡）紫黑紫黑、粉紅菌落特征粉紅膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)專題知識(shí)講座第25頁(yè)慣用器材擺放次序：電源插座→試管架→酒精燈→污物盤。試管架上器材：靠近插座一側(cè)第1列放置接