分子篩凝膠層析

實驗三分子篩凝膠層析一、實驗?zāi)康恼莆掌暇厶悄z的特性及凝膠層析的原理；學(xué)習(xí)葡聚糖凝膠層析的基本操作技術(shù)。二、實驗原理凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體，它們的內(nèi)部有很細(xì)微的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。目前關(guān)于凝膠層析的原理有許多假設(shè)和理論，普遍接受的是分子篩效應(yīng)。凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡，充分吸液膨脹，然后裝入層析柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，流速緩慢，以至最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離。對凝膠層析分離的簡單過程可用圖1表示。i小分子i小分子凝膠顆粒圖1小分子由于擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留，大分子被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過本實驗是分子篩凝膠過濾法的初步訓(xùn)練，采用葡聚糖凝膠G-25，以水為洗脫溶劑，層析分離大分子紅葡聚糖和小分子維生素b12。三、試劑和器材試劑[1]藍(lán)葡聚糖-b12混合液⑵葡聚糖凝膠SephadexG-25器材[1]層析柱：柱管（1厘米x20厘米），附有一小段乳膠管及螺旋夾⑵洗脫瓶（下口錐形瓶，250mL）試管及試管架量筒（10mL）721分光光度計四、操作（一）凝膠的預(yù)處理（教師準(zhǔn)備）為使樣品通過凝膠時具有良好的流速并能很好的分離，應(yīng)對凝膠進(jìn)行預(yù)處理。（1）凝膠必須于使用前在過量的溶劑中充分地膨脹。（2）用傾瀉法除去混雜的細(xì)小顆粒，重復(fù)3-4次。在膨脹時間內(nèi)，應(yīng)避免劇烈攪拌，以防止破壞交鏈結(jié)構(gòu)。（二）柱的選擇為了防止分離受管壁效應(yīng)影響，一般應(yīng)選用內(nèi)徑大于2.5厘米的柱。為了便于組織拆卸，下口可取一個適當(dāng)削磨過的橡皮塞倒插入管底，這種裝法亦可避免層析柱的死區(qū)而有利分離。橡皮塞上還覆蓋一層尼龍綢或脫脂棉，以防止葡聚糖顆粒流出。（三）裝柱裝柱是凝膠層析中最重要的一步操作，實驗時必須將凝膠床裝得十分均勻。首先，將柱垂直地安裝好。層析柱下端及尼龍綢必須充以溶劑，不能留有氣泡，然后，將已膨脹的凝膠沿著玻璃棒小心地徐徐灌到柱中，盡量一次裝完，以免出現(xiàn)不均勻的凝膠帶，為此在裝柱時需打開下口，并調(diào)節(jié)適應(yīng)的流速。灌注時，凝膠懸漿切不可太稀或太粘。若太稀，分幾次裝出的凝膠床往往不是均勻的，過于粘稠，會吸留氣泡。（四）加樣打開柱的下口，讓溶劑（水）逐漸流出。待到床面上只留下極薄的一層溶劑時，關(guān)閉出口管上的螺旋夾。用吸量管取3-5滴混合液，小心地將此樣品加到凝膠床的表面上。注意加樣時勿將床面凝膠沖起，亦不要沿柱壁滴加樣品，因為這樣樣品易從柱壁與凝膠床之間漏下。然后，打開出口管，待樣品恰好進(jìn)入床后，用少量水沖洗一下凝膠表面和接觸過樣品的柱壁，待安全流進(jìn)床內(nèi)后，再加水進(jìn)行擴(kuò)展洗脫。在全部操作期間，要避免柱床流干。（五）洗脫加蒸餾水洗脫，用小量筒收集洗脫液，用螺旋零部件調(diào)節(jié)洗脫速度為0.5?lQmL/分，每次1mL，依次倒入已預(yù)先編好號碼的試管中，觀察并記錄洗脫中的現(xiàn)象。收集15管左右，先收集的一部分溶液呈藍(lán)色，后收集的一部分溶液呈紅色。每管加入蒸餾水1mL，稀釋1倍，倒入0.5厘米厚的比色皿中，于分光光度計測定光密度，藍(lán)色溶液部分在680nm波長下測定，紅色溶液部分再520nm波長下測定。以mL數(shù)（或管數(shù)）為橫坐標(biāo)，繪出洗脫曲線。五、實驗結(jié)果與討論編號12345678藍(lán)680nm0.1210.2420.072紅520nm0.1310.2190.3160.2970.2410.172編號9101112131415藍(lán)680nm紅520nm0.1090.0670.0410.0310.0110.0140.007凝膠層析洗脫曲線樣品試管序號利用凝膠層析法分離混合樣品時，怎樣才能得到較好的分離效果？答：①裝柱時要注意凝膠的流速，不宜過快，同時要保證凝膠能充分的沉淀且分布的比較均勻，分離柱加樣頭部凝膠需保持水平。②凝膠溶脹所用的溶液應(yīng)與洗脫用的溶液相同，否則由于更換溶劑，凝膠體積會發(fā)生變化而影響分離效果。③樣品的濃度和加樣量的多少是影響分離效果的重要因素。樣品濃度應(yīng)適當(dāng)大，但大分子物質(zhì)的濃度大時，溶液的黏度也隨之變大，會影響分離效果，要兼顧濃度與黏度兩方面。加樣量和加樣體積越少分離效果越好，加樣量一般為柱床體積的1%-2%，制備用量一般為柱床體積的20%-30%。比較凝膠層析與紙層析在實驗原理上的區(qū)別。紙層析法又稱紙色譜法，是用濾紙為支持物，所用展層溶劑大多由水和有機(jī)溶劑組成，濾紙纖維與水的親和力強(qiáng)，與有機(jī)溶劑的親和力弱，因此在展層時，紙纖維上吸附的水分是固定相，有機(jī)溶劑是流動相。將樣品點(diǎn)在濾紙上進(jìn)行展層，樣品物質(zhì)在兩相溶劑中不斷進(jìn)行分配。由于它們的分配系數(shù)不同，隨流動相移動的速率就不同，于是就將這些物質(zhì)分離開來。凝膠層析是