質(zhì)譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用

質(zhì)譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用主要內(nèi)容發(fā)展概述質(zhì)譜法分析原理及過程質(zhì)譜儀的組成LC-MS聯(lián)用技術(shù)LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展概述ThomsonJ.J于1906年發(fā)明質(zhì)譜，到20世紀(jì)20年代質(zhì)譜才逐漸被化學(xué)家以一種分析手段采用。早期的質(zhì)譜儀主要用來進行同位素測定和無機元素分析，40年代以后質(zhì)譜開始廣泛應(yīng)用于有機化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，直到80年代，有機質(zhì)譜及質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)得到了飛速的發(fā)展。相繼發(fā)明了快原子轟擊、電噴霧電離、大氣壓化學(xué)電離和基質(zhì)輔助激光解吸電離等軟電離技術(shù)，能用于分析高極性、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定樣品，使質(zhì)譜的應(yīng)用擴大到生物大分子的領(lǐng)域。質(zhì)譜分析的原理

質(zhì)譜儀是一種測量帶電粒子質(zhì)合比的裝置，利用帶電粒子在電場和磁場中運動（偏轉(zhuǎn)、漂移、震蕩）行為進行分離與測量。在離子源中樣品分子被電離和解離，得到分子離子和碎片離子，將分子離子和碎片離子引入到一個強的電場中，使之加速，加速電位通常用到6-8kV,此時所有帶單位正電荷的離子獲得的動能都一樣，即

eV=mv2/2

但是，不同質(zhì)荷比的離子具有不同的速度，利用離子的不同質(zhì)荷比及其速度差異，質(zhì)量分析器可將其分離，然后由檢測器測量其強度。記錄后獲得一張以質(zhì)荷比（m/z）為橫坐標(biāo)，以相對強度為縱坐標(biāo)的質(zhì)譜圖。質(zhì)譜分析過程質(zhì)譜分析過程可以分為四個基本環(huán)節(jié)：通過合適的進樣裝置將樣品引入并進行氣化氣化后的樣品引入到離子源進行電離，即離子化過程電離后的離子經(jīng)過適當(dāng)?shù)募铀俸筮M入質(zhì)量分析器，按不同的質(zhì)荷比進行分離經(jīng)檢測、記錄，獲得一張譜圖上述過程可歸納在圖1中。質(zhì)譜儀的組成

典型的質(zhì)譜儀一般由進樣系統(tǒng)、離子源、分析器、檢測器和記錄系統(tǒng)等不分組成，此外，還包括真空系統(tǒng)和自動控制數(shù)據(jù)處理等輔助設(shè)備。下圖為單聚焦質(zhì)譜儀的示意圖真空系統(tǒng)

質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作，以減少本底的干擾，避免發(fā)生不必要的離子-分子反應(yīng)。所以質(zhì)譜反應(yīng)屬于單分子分解反應(yīng)。利用這個特點，我們用液質(zhì)聯(lián)用的軟電離方式可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子，從而得到分子量。由機械真空泵(前極低真空泵)，擴散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機組，抽取離子源和分析器部分的真空。只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達接收器，真空度不夠則靈敏度低。進樣系統(tǒng)把分析樣品導(dǎo)入離子源的裝置，包括：直接進樣，GC，LC及接口，加熱進樣，參考物進樣等。離子源

使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)的裝置，并對離子進行加速使其進入分析器，根據(jù)離子化方式的不同，有機質(zhì)譜中常用的有如下幾種，其中EI，ESI最常用。EI(ElectronImpactIonization):電子轟擊電離—硬電離。CI(ChemicalIonization):化學(xué)電離—核心是質(zhì)子轉(zhuǎn)移。FD(FieldDesorption):場解吸—目前基本被FAB取代。FAB(FastAtomBombardment):快原子轟擊—或者銫離子(LSIMS,液體二次離子質(zhì)譜)。

ESI(ElectrosprayIonization):電噴霧電離—屬最軟的電離方式。適宜極性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白質(zhì)分子多肽等)

APCI(AtmosphericPressureChemicalIonization):大氣壓化學(xué)電離—同上，更適宜做弱極性小分子。APPI(AtmosphericPressurePhotoSprayIonization):大氣壓光噴霧電離—同上，更適宜做非極性分子。

MALDI(MatrixAssistedLaserDesorption):基體輔助激光解吸電離。通常用于飛行時間質(zhì)譜和FT-MS，特別適合蛋白質(zhì)，多肽等大分子．其中ESI，APCI，APPI統(tǒng)稱大氣壓電離(API)

軟電離技術(shù)20世紀(jì)80年代中期出現(xiàn)的兩種新的電離技術(shù):電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)，這兩種技術(shù)具有高靈敏和高質(zhì)量檢測范圍,能在飛摩(10-15)乃至阿摩(10-18)水平檢測相對分子量高達幾十萬的生物大分子。目前，這兩種技術(shù)廣泛用于生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域的研究。電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)(ESI)ESI的工作原理：利用位于一根毛細管和質(zhì)譜進口間的電勢差生成離子，在電場的作用下產(chǎn)生一噴霧形式存在的帶電液滴。在迎面吹來的熱氣流的作用下，液滴表面溶劑蒸發(fā),液滴變小，液滴的電荷密度驟增。當(dāng)靜電排斥力等于液滴的表面張力時，液滴便發(fā)生崩解，形成更小的液滴。如此形成的小液滴以類似的方式繼續(xù)崩解，于是液滴中的溶劑迅速蒸干，產(chǎn)生多電荷正離子，在質(zhì)譜儀內(nèi)被分析紀(jì)錄。電噴霧電離的特征之一是可生成高度帶電的離子而不發(fā)生破裂，這樣可將質(zhì)荷比降低到各種不同類型的質(zhì)量分析儀都能檢測的程度。

電噴霧通常應(yīng)用于FT2MS。Little等利用FT2MS對一個50鏈寡聚糖核苷酸得到了優(yōu)于10μg/g的質(zhì)量測定準(zhǔn)確度;對一個100鏈寡聚核苷酸,質(zhì)量準(zhǔn)確度優(yōu)于30μg/g。測定的寡聚物的分子量可用于順序確證,也可與氣相裂解結(jié)合來進行序列測定。ChenR等用FT2ICR2MS來捕獲和檢測質(zhì)量超過108D的單個DNA離子。

ESI的優(yōu)點是:解決了極性大、熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)與多肽分子的離子化和大分子質(zhì)量、一級結(jié)構(gòu)和共價修飾位點的測定問題,并可用于研究DNA與藥物、金屬離子、蛋白質(zhì)和抗原與抗體的相互作用。但是樣品中的鹽類對樣品結(jié)果影響很大,而且單個分子帶電荷不同可形成多種離子分子峰(重疊峰),所以對混合物的圖譜解析比較困難。

基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)(MALDI)是用小分子有機物作為基質(zhì),樣品與基質(zhì)的分子數(shù)比例為1:(10050000),均勻混合后,在空氣中自然干燥后送入離子源內(nèi)?；旌衔镌谡婵障率芗す廨椪?基質(zhì)吸收激光能量,并轉(zhuǎn)變?yōu)榛|(zhì)的電子激發(fā)能,瞬間使基質(zhì)由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài),形成基質(zhì)離子。而中性樣品與基質(zhì)離子、質(zhì)子及金屬陽離子之間的碰撞過程中,發(fā)生了樣品的離子化,從而產(chǎn)生質(zhì)子化分子、陽離子化分子或多電荷離子或多聚體離子。常用的是基質(zhì)輔助激光解吸離子-飛行時間-質(zhì)譜。目前還有更新的串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜技術(shù)。Crimmins等用MALDI-TOFMS分析通過二硫鍵鍵合的異二肽,得到了二肽及每個單體肽組分的質(zhì)量。結(jié)論是MALDI-TOFMS中的碎裂過程與氨基酸胱氨酸水溶液的光引發(fā)均裂有相似之處。提供了一種指認蛋白中二硫鍵的簡便方法。此方法還適用于對單核細胞進行直接的化學(xué)分析。

MALDI的特點是準(zhǔn)分子離子峰很強,幾乎無碎片離子,因此可直接分析蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的多肽混合物。另一個特點是對樣品中雜質(zhì)的耐受量較大,當(dāng)用液體色譜分離蛋白質(zhì)是,往往把鹽留在樣品中,若這些鹽的量在基質(zhì)的5%以下,可不影響蛋白質(zhì)離子的發(fā)射,因而往往可省去脫鹽的步驟,大大縮短分析時間。2.基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)(MALDI)質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀中將離子按質(zhì)荷比分開的部分,離子通過分析器后,按不同質(zhì)荷比(M/Z)分開,將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質(zhì)譜。

質(zhì)量分析器的分類：雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector).四極桿質(zhì)譜儀(Q).飛行時間質(zhì)譜儀(TOF).離子阱質(zhì)譜儀（TRAP）傅里葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICRMS).┏四極+TOF（Q-TOF）串列式多級質(zhì)譜儀┫三重四極（QqQ）

(MS/MS) ┗TOF+TOF檢測接收器

接收離子束流的裝置有：電子倍增器、光電倍增器、微通道板將接收來的電信號放大、處理并給出分析結(jié)果及控制質(zhì)譜儀個部分工作。從幾伏低壓到幾千伏高壓。數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)色譜質(zhì)譜聯(lián)用簡介

色譜質(zhì)譜的在線聯(lián)用將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。色譜質(zhì)譜聯(lián)用包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用互為補充，分析不同性質(zhì)的化合物。

液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別

氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比。

液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。

LC-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展

質(zhì)譜法可以有效地定性分析化合物,但對于有機混合物的分析就無能為力了。而色譜法對有機化合物是一種有效的分離和分析方法,特別適合進行有機化合物的定量分析,但定性分析比較困難。因此兩者的有效結(jié)合必將為化學(xué)家及生物化學(xué)家提供一個進行復(fù)雜化合物高效的定性定量工具。色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)主要有氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法。GC-MS技術(shù)已經(jīng)成為一種成熟的分析方法應(yīng)用于很多領(lǐng)域。但是在1000多萬種已經(jīng)登錄的有機化合物中大概只有不到20%可以直接采用GC-MS進行分析。事實上在理化物證分析領(lǐng)域內(nèi)對炸藥、染料、塑料等的分析也遇到類似的情況。即使采用高的氣化溫度、短的停留時間有時還不能奏效。液相色譜--質(zhì)譜儀

高效液相液質(zhì)聯(lián)用(HPLC/MS)是指高效液相液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)的技術(shù)。HPLC-MS主要由HPLC儀、接口離子源(HPLC與MS之間的連接裝置)、質(zhì)量分析器、真空系統(tǒng)和計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成?；旌蠘悠吠ㄟ^液相色譜系統(tǒng)進樣，由色譜柱分離，從色譜儀流出的被分離組分依次通過接口進入MS儀的離子源處并被離子化,然后離子被聚焦于質(zhì)量分析器中，根據(jù)質(zhì)荷比而分離，分離后的離子信號被轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，根據(jù)MS峰的強度和位置對樣品的成分和結(jié)構(gòu)進行分析。目前常用的HPLC-MS聯(lián)用儀具有兩大分類系統(tǒng)，一種是從MS的離子源角度來劃分,包括電噴霧離子(ESI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI)和基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)等；另一種是從MS的質(zhì)量分析器角度來劃分，包括四級桿質(zhì)譜儀(Q-MS)、離子阱質(zhì)譜儀(IT-MS)、飛行時間質(zhì)譜儀(TOF-MS)、傅立葉變換質(zhì)譜儀(FT-MS)。

自1968年發(fā)表第一篇HPLC和MS在線聯(lián)用的實驗報告至90年代初形成的5種接口類型的商品儀器,經(jīng)歷了30年。LC-MS經(jīng)歷了一個漫長的研究過程,主要是為了解決真空技術(shù)和性能優(yōu)越的接口技術(shù)。為解決質(zhì)譜分析所必須的真空度,LC-MS一般都采用分段、多級抽真空的方法。與GC-MS聯(lián)用相比,接口問題的解決過程是艱巨的。主要原因來自兩方面:一是真空;二是樣品性質(zhì)。也就是說質(zhì)譜儀的高真空系統(tǒng)不適應(yīng)HPLC的流出液體；強極性、難汽化和熱不穩(wěn)定的樣品不適應(yīng)質(zhì)譜的常規(guī)進樣和離子化方式。

LC-MS在發(fā)展的過程中曾出現(xiàn)了很多接口技術(shù),現(xiàn)在在線聯(lián)用接口匯集成商品化的5種接口為傳送帶(MB)、流動快原子轟擊(CFFAB)、粒子束(PB)、熱噴霧(TSP)以及大氣壓電離(API)。其中API技術(shù)盡管不能全部代替其他4種接口,但它的出現(xiàn)使HPLC方法可以對強極性、高熔點、低揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性樣品進行分析,因此逐漸受到法庭科學(xué)工作者的青睞。API技術(shù)分為電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI),目前商業(yè)化的LC-MS絕大多數(shù)使用這兩種接口,下面簡單介紹這兩種接口的特點。1.電噴霧電離(ESI)

ESI是高電壓加在毛細管噴口上,通過電動噴霧,霧化的液滴經(jīng)去溶劑化最終成為樣品的準(zhǔn)分子離子,電噴霧由此而得名。ESI有正離子化和負離子化兩種模式可供選擇,堿性樣品一般選擇正離子化模式,酸性樣品一般選擇負離子化模式。具有離子化效率高、靈敏度高、分析范圍廣等優(yōu)點。它可以形成多電荷離子分析大分子如多肽、蛋白質(zhì)等,也可形成單電荷離子分析較小分子量(<1000amu)的極性化合物,如小分子藥物及其代謝物,用于農(nóng)藥及化工產(chǎn)品的中間體和雜質(zhì)的鑒定。

2.大氣壓化學(xué)電離(APCI)

APCI是樣品進入氣相后依賴電暈放電發(fā)生離子化。被分析物隨溶液一起通過不銹鋼探針,同時被加熱氣化,其溶膠進入離子源,借助電暈放電而帶電,隨后分子、離子之間進行電荷轉(zhuǎn)移(化學(xué)反應(yīng))使被反應(yīng)物帶電與GC-MS不同的是并不需要反應(yīng)氣。與ESI相比,所要求的液相色譜流動相流速可在0.2ml/min-2ml/min,這樣對于選擇色譜柱和優(yōu)化色譜條件十分方便,而要求流動相流速控制在1.0ml/min以下。但是APCI不能形成多電子離子,這使得它的質(zhì)量分析范圍沒有ESI廣,有些化合物使用兩種接口技術(shù)均可進行分析,一般極性低的化合物多使用接口APCI,APCI的靈敏度較ESI好。1.接口的選擇：

ESI適合于中等極性到強極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)）

APCI不適合可帶多個電荷的大分子，其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析。LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化各種接口的應(yīng)用范圍非極性101102103104105分子質(zhì)量離子鍵IonSprayAPCIGC/MS電噴霧LC-MS熱噴霧和常壓化學(xué)離子化LC-MS待測物極性幾種API接口示意圖2.正、負離子模式的選擇：選擇的一般原則為：正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。負離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。樣品中含有較多的強伏電性基團，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負離子模式。3.流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。LC／MS接口避免進入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須＜lmmol/l。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸銨＜10一5mmol/l。送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。4.流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是1—50ul／min，應(yīng)用4.6mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用l—2.1mm內(nèi)徑的微柱，TIS源最高允許lml／min，建議使用200—400ul／minAPCI的最佳流速～lml／min，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。為了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間。5.輔助氣體流量和溫度的選擇

霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級質(zhì)譜的產(chǎn)生。操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點20℃

左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成，有機溶劑比例高時可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c的。LC-MS技術(shù)的應(yīng)用

目前飛速發(fā)展的質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已成為一種常規(guī)的應(yīng)用技術(shù)。世界各國的科學(xué)技術(shù)以日新月異的速度飛速發(fā)展,新技術(shù)的產(chǎn)生、儀器設(shè)備的更新非?？臁Ｔ趪鴥?nèi),質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)主要用于藥動學(xué)和代謝研究等藥學(xué)領(lǐng)域。而國外在過去幾十年里,由于接口技術(shù)的發(fā)展使質(zhì)譜的應(yīng)用逐漸擴展到生物大分子、環(huán)境衛(wèi)生等生命科學(xué)領(lǐng)域,促進了相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。以大氣壓電離為接口的LC-MS技術(shù)已經(jīng)在藥物、化工、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等許多領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用。具體應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥學(xué)：藥物代謝、藥物動力學(xué)、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析生物化學(xué)：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖環(huán)境化學(xué)：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機污染物、土壤/食品/水分析臨床醫(yī)學(xué)：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿病）、血紅蛋白變異、膽酸食品科學(xué)：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物法醫(yī)學(xué)：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測獸醫(yī)學(xué)：興奮劑、磺胺類藥物、抗體合成化學(xué)：有機金屬化合物、有機合成物有機化學(xué)：表面活性劑、染料藥物代謝研究

藥物代謝與藥物動力學(xué)研究技術(shù)上的最新重大進展是LC-MS-MS的使用，電噴霧（ESI）和