細菌性疫苗的生產(chǎn)工藝

細菌性疫苗的生產(chǎn)工藝第1頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六細菌性疫苗對某一特定傳染病產(chǎn)生或增加人工免疫力的制劑,包括死亡的微生物(死毒)、活的但減弱其毒性的(弱毒)以及活的毒性充分的(強毒)三種。一般分為活菌苗及死菌苗兩類。第2頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六分類活菌苗：常用者有預防結核病的卡介（BCG）、鼠疫活菌苗等。制備活菌苗的關鍵在于獲得減毒或無毒菌株，但該菌株應保持免疫原性?；罹缃臃N后，在體內(nèi)有一定的生長繁殖能力，類似經(jīng)型或隱性感染。一般只需接種一次，且需量較小，但引起的免疫效果好，且能維持較長時間。死菌苗：用化學或物理方法將病原菌殺死后仍保持免疫原性可制備死菌苗。常用的死菌苗有霍亂、傷寒、副傷寒甲、乙混合菌苗、百日咳菌苗等。死菌苗大多需要多次接種才能獲得較好的免疫效果。為減少死菌苗的接種次數(shù)，現(xiàn)常將不同種類的死菌苗作合理混合，制成聯(lián)合菌苗，如傷寒菌、甲、乙型副傷寒菌混合的三聯(lián)菌苗。第3頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六第4頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六第5頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六類毒素又稱減力毒素，變性毒素。一些經(jīng)變性或經(jīng)化學修飾而失去原有毒性而仍保留其免疫原性的毒素。醫(yī)學微生物學中將類毒素定義為：將細菌外毒素用0.3%~0.4%甲醛處理脫去其毒性，保存其免疫原性即為類毒素第6頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六第7頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六菌種的選擇菌種必須具有特定的抗原性，能使機體誘發(fā)特定的免疫反應；菌種應具有典型的形態(tài)、培養(yǎng)特性和生化特性，并在傳代的過程中，能長期保持這些特性；菌種應易于在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)；制備滅活菌苗，菌種在培養(yǎng)過程中應產(chǎn)生較小的毒性；制備活菌苗，菌種在培養(yǎng)過程中應無恢復原毒性的現(xiàn)象；制備毒素，菌種在培養(yǎng)過程中應能產(chǎn)生大量的典型毒素。制備菌苗和類毒素的菌種，應該是生物學特性穩(wěn)定，能獲得安全性好、效力高的生物制品的菌種。第8頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求除碳源、氮源和各種無機鹽類等培養(yǎng)微生物所需要的一般營養(yǎng)要素外，由于某些微生物生理上的特殊性，往往需要某些特殊營養(yǎng)物才能生長。例如結核桿菌需以甘油作為碳源；有些分解糖類能力較差的梭狀芽孢桿菌需以氨基酸作為能量及碳與氮的來源。培養(yǎng)致病菌時，在培養(yǎng)基中除應含有一般碳源、氮源和無機鹽成分外，往往還需添加某種生長因子。第9頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六菌種制備菌種使用前應進行培養(yǎng)特性、血清學特性、毒力試驗、毒性試驗、抗原性試驗、免疫力性試驗的檢定。

一代種子：凍干菌種接種于適宜的培養(yǎng)基上，于37℃±1℃培養(yǎng)一定的時間。二代種子：一代種子接種于適宜的培養(yǎng)基上，于37℃±1℃進行擴大培養(yǎng)。菌種開啟后用于生產(chǎn)時不能超過規(guī)定的傳代數(shù)。第10頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六培養(yǎng)根據(jù)不同的菌種和要求選擇適合的培養(yǎng)基，常用的培養(yǎng)方法有固體培養(yǎng)法和液體深層培養(yǎng)法。大規(guī)模生產(chǎn)多采用液體深層通氣培養(yǎng)法。細菌培養(yǎng)時應注意下述4種因素的控制。⒈氣體各種細菌在生長時對癢的要求不同。在培養(yǎng)特定的細菌時，必須嚴格控制培養(yǎng)基環(huán)境的氧分壓。⒉溫度致病菌的最適培養(yǎng)溫度大都接近人體的正常溫度（35~37℃）。在制備菌苗時，必須先找出菌種的最適培養(yǎng)溫度，在生產(chǎn)工藝中加以嚴格控制，以獲得最大的產(chǎn)量和保持細菌的生物學特性和抗原性。第11頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六⒊PH值同一細菌能在不同的PH值下生長。培養(yǎng)的PH值不同，細菌的代謝產(chǎn)物有可能不同。因此，在培養(yǎng)細菌時，應嚴格控制培養(yǎng)基的PH值，以使它們按預定的要求生長、繁殖和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。⒋光線制備生物制品的細菌，一般都不是光合細菌，不需要光線的照射。故培養(yǎng)不應在陽光或X射線下進行，以防止核糖核酸分子的變異，從而改變細菌的生物學特性。第12頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六收菌固體培養(yǎng)法培養(yǎng)的細菌，在采集時應逐瓶檢驗，污染雜菌的廢棄，未污染的將軍苔刮入含PBS的大瓶中。液體培養(yǎng)時，將培養(yǎng)液直接收集到大瓶或其他容器中，逐瓶進行無菌試驗，污染雜菌的廢棄。PBS:全稱PhosphateBufferedSaline.在醫(yī)學詞匯中表示磷酸鹽緩沖液，用于分子克隆及細胞培養(yǎng)，pH=7.4,與人體血液等滲，主要成分為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉及氯化鉀?！恪愕?3頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六殺菌滅活疫苗制劑在制成原液后需要用物理或化學方法殺菌，各種菌苗所用的殺菌方法不相同，但殺菌的總目標是徹底殺死細菌而又不影響菌苗的防病效力。以傷寒菌苗為例，可用加熱殺菌、甲醛溶液殺菌、丙酮殺菌等方法殺死傷寒桿菌。我國多采用甲醛作為殺菌劑，甲醛的終濃度不超過1％（體積分數(shù)，ml/ml），置37℃一定時間或2~8℃一定時間殺菌。殺菌后的原液還要進行無菌檢查，方法是：取樣接種于不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培、養(yǎng)基瓊脂斜面及堿性置各1支，置37℃培養(yǎng)5天，應無本菌生長。第14頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六原液檢定與保存1、濃度測定應按《中國細菌濁度標準》測定濃度2、鏡檢涂片染色鏡檢，至少觀察10個視野，應該菌形典型且無雜菌。3、凝集試驗用相應血清做定性凝集試驗，呈陽性反應。4、無菌試驗需氧菌、厭氧菌及真菌試驗呈陽性。5、免疫力試驗以一定菌數(shù)的劑量免疫小鼠，再用致病菌攻擊小鼠，觀察并記錄小鼠死亡數(shù)，計算ED50或LD50結果，達到要求即合格。6、原液保存2~8℃保存。自采集之日起有效期一般為3～4年第15頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六稀釋、分裝和凍干經(jīng)殺菌的溶液，一般用含防腐劑的緩沖生理鹽水稀釋至所需濃度，然后在無菌條件下分裝于適當?shù)娜萜?，封口后?～10℃保存，直至使用。有些菌苗，特別是活菌苗，亦可于分裝后冷凍干燥，以延長它們的有效期。第16頁，共18頁，2023年，2月20日，星期六ED50（半數(shù)有效量）：指在量反應中能引起百分之五十最大反應強度的藥物