抗腫瘤藥物篩選專家講座

內(nèi)容提要一細(xì)胞篩選二微生物學(xué)篩選方法三精原細(xì)胞法四利用分子靶點篩選五動物模型六基因芯片技術(shù)抗腫瘤藥物篩選專家講座第1頁一細(xì)胞篩選抗腫瘤藥物篩選專家講座第2頁篩選方法1.四氮唑藍(lán)（MTT）還原法原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功效。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值抗腫瘤藥物篩選專家講座第3頁

試驗組光吸收值（A）細(xì)胞存活率=×100%對照組光吸收值（A）可用細(xì)胞存活率對劑量作圖求出IC50值抗腫瘤藥物篩選專家講座第4頁應(yīng)用：生物活性因子活性檢測、大規(guī)模抗腫瘤藥品篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。特點：靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。

缺點：產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。抗腫瘤藥物篩選專家講座第5頁步驟：（1）制備單細(xì)胞懸液；(2)對細(xì)胞計數(shù)后接種于96孔板，普通5000個/孔（可先做細(xì)胞倍增試驗確定每孔中最正確細(xì)胞數(shù)）；（3）將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)；（4）24h后更換培養(yǎng)基，并在每孔細(xì)胞中加入不一樣濃度藥品，繼續(xù)培養(yǎng)；（5）24或48h以后，加入MTT溶液，再培養(yǎng)3-6h,停頓培養(yǎng)，棄取培養(yǎng)基,加入DMSO，每孔150ul，輕微震蕩混勻；（6）把96孔板放入酶標(biāo)儀中，490nm測定吸光度。注意：設(shè)好對照抗腫瘤藥物篩選專家講座第6頁抗腫瘤藥物篩選專家講座第7頁抗腫瘤藥物篩選專家講座第8頁CCK-8法抗腫瘤藥物篩選專家講座第9頁2.集落形成法：注意：適合貼壁細(xì)胞，細(xì)胞要分散均勻，操作要柔和。3.臺盼藍(lán)排斥試驗特點：懸浮細(xì)胞較方便，貼壁細(xì)胞要進(jìn)行消化，此步誤差大?？鼓[瘤藥物篩選專家講座第10頁二微生物學(xué)篩選方法(抗腫瘤抗生素)1.噬菌體法2.細(xì)菌變種法3.抗代謝法抗腫瘤藥物篩選專家講座第11頁1.噬菌體法噬菌體：是一類能感染微生物病毒抗腫瘤藥物篩選專家講座第12頁（1）抗噬菌體法：干擾DNA代謝抗生素如放線菌素、博來霉素常能抑制噬菌體在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)生長，從而不產(chǎn)生噬菌體顆粒而出現(xiàn)抗噬菌體現(xiàn)象。（2）溶原性菌誘導(dǎo)法：除烈性噬菌體外，還有一個噬菌體，其基因組直接螯合到細(xì)菌染色體DNA，不復(fù)制，因其大部分基因功效受到了“阻遏物”阻抑，這種帶前噬菌體菌株稱溫和性或溶原性菌。不過當(dāng)“阻遏物”量因為細(xì)胞內(nèi)或環(huán)境因子（物理、化學(xué)）而降低時，溶原性就不能維持，前噬菌體開始生長，是細(xì)菌裂解，稱為誘導(dǎo)作用。一些抗腫瘤抗生素有誘導(dǎo)能力。抗腫瘤藥物篩選專家講座第13頁2.細(xì)菌變種法(1)人工培育變種

如:使細(xì)菌模仿腫瘤細(xì)胞一些代謝特點使細(xì)菌對核酸或蛋白合成抑制劑敏感(2)檢測突變作用如:依賴鏈霉素菌株抗腫瘤藥物篩選專家講座第14頁3.抗代謝法

抗代謝物在無機(jī)氮源合成培養(yǎng)基中顯示抗菌作用，而在普通有機(jī)氮源營養(yǎng)培養(yǎng)基中無抗菌作用（因為有機(jī)氮源可將含有抗菌作用物質(zhì)代謝），利用此特點，選擇無機(jī)氮源試驗有抗菌作用物質(zhì)，作為抗代謝初篩方法?？鼓[瘤藥物篩選專家講座第15頁三精原細(xì)胞法(抗生素和植物藥)1.建立依據(jù)B型精原細(xì)胞含有高度敏感性2.試驗方法及判定22－28g雄性小鼠，藥品直接注入睪丸，不一樣濃度，每一濃度用2－3只，注射3天，處死動物，睪丸固定，石蠟包埋切片，蘇木精－伊紅染色，顯微鏡觀察?？鼓[瘤藥物篩選專家講座第16頁四利用分子靶點篩選1.抑制血管生成篩選模型體外：血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體內(nèi)：動物眼角膜囊地鼠頰囊裸鼠外耳皮下雞胚絨毛尿囊膜抗腫瘤藥物篩選專家講座第17頁雞胚絨毛尿囊膜模型雞胚生物學(xué)結(jié)構(gòu)尿囊卵黃囊抗腫瘤藥物篩選專家講座第18頁抗腫瘤藥物篩選專家講座第19頁對照組低濃度藥品試驗組中濃度藥品試驗組高濃度藥品試驗組抗腫瘤藥物篩選專家講座第20頁抗腫瘤藥物篩選專家講座第21頁操作步驟：（1）于試驗前72h孵育受精蛋（2）試驗進(jìn)行前以照蛋箱透照孵育種蛋，凡已正常發(fā)育種蛋可照見胚胎影子，用鉛筆做記號，棄取未發(fā)育種蛋（3）用碘酒、酒精消毒蛋殼。敲碎蛋殼把雞胚移入平皿中，加入EagleFs培養(yǎng)液5-10ml，然后，可選擇在雞胚尿囊膜血管網(wǎng)任何位置放置小塊明膠海綿作為篩選抗血管生成藥品載體，然后加入不一樣濃度血管生成抑制劑。（4）于加藥后24h、48h和72h分別在顯微鏡下觀察藥品作用結(jié)果，并攝影。（5）血管計數(shù)?？山Y(jié)合自動圖像分析系統(tǒng)、攝像等技術(shù)完成血管生成抑制率＝（對照組血管面積－藥品組血管面積）/對照組血管面積×100％抗腫瘤藥物篩選專家講座第22頁2.以端粒酶為靶點藥品篩選端粒：真核細(xì)胞染色體末端特殊結(jié)構(gòu)。維持染色體穩(wěn)定性。“生命時鐘”“有絲分裂計數(shù)器”端粒酶功效：經(jīng)過其逆轉(zhuǎn)錄酶活性復(fù)制和延長端粒DNA來穩(wěn)定染色體DNA端粒長度。端粒酶活性測定方法端粒酶抑制劑抗腫瘤藥物篩選專家講座第23頁3.細(xì)胞凋亡通路靶點

抗腫瘤藥物篩選專家講座第24頁細(xì)胞周期調(diào)控靶點與侵襲相關(guān)靶點耐藥相關(guān)分子靶點靶點選擇標(biāo)準(zhǔn)：特異性、有效性、綜合性、個性化抗腫瘤藥物篩選專家講座第25頁五動物模型整體動物試驗法是評價一個藥品是否有效最主要方法整體動物在腫瘤藥理學(xué)研究中作用：1.研究新開發(fā)藥品對腫瘤防治作用；2.抗腫瘤藥品篩選及抗腫瘤機(jī)理探索；3.探索藥品和當(dāng)前常規(guī)腫瘤治療方法綜合應(yīng)用以提升療效?？鼓[瘤藥物篩選專家講座第26頁

慣用宿主動物：裸小鼠（“活試管”）特點：先天無毛，無胸腺，T淋巴細(xì)胞功效完全缺失，對異種移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。缺點：費用高，喂養(yǎng)條件高，不宜大量繁殖。普通不用于初篩。應(yīng)用：觀察藥品對癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)作用，抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用。抗腫瘤藥物篩選專家講座第27頁C57BL/6小鼠特點：黑毛，體型小，性情溫順，易喂養(yǎng)，藥敏性好，為研究Lewis肺癌首選。

應(yīng)用：藥品體內(nèi)初篩?？鼓[瘤藥物篩選專家講座第28頁模型建立方法實體瘤建立1.小塊瘤體接種法2.腫瘤細(xì)胞懸液接種法3.培養(yǎng)細(xì)胞移植法治療方案：接種后生長至可觸及即可治療，依藥品特征及研究目確實定方案，可給藥一次，或連續(xù)幾次，或一周幾次連續(xù)幾周。療效評價：腫瘤抑制率＝（對照組瘤重－給藥組瘤重）/對照組瘤重×100％抗腫瘤藥物篩選專家講座第29頁腹水瘤建立及評價：評價：對照組通常2-3周內(nèi)死亡，治療組普通觀察50d左右，計算生命延長率。生命延長率＝（治療組平均存活天數(shù)－對照組平均存活天數(shù)）/對照組平均存活天數(shù)×100％注意事項：1.取材時取實質(zhì)部位，不要取壞死、液化部位，預(yù)防污染。2.試驗前先喂養(yǎng)裸鼠一周，以適應(yīng)新環(huán)境，若死亡超出10%不可用，普通18-22g，4-6周齡。3.喂養(yǎng)環(huán)境及鼠籠、墊料、飼料嚴(yán)格消毒4.保持恒溫，普通25±1℃，濕度40-60%，天天10h光照、14h黑暗?？鼓[瘤藥物篩選專家講座第30aysTumorValume(mm3)ACabcdBab抗腫瘤藥物篩選專家講座第31頁六基因芯片技術(shù)1.原理是一個建立在雜交測序基本理論上全新技術(shù)，它利用固定在芯片上幾萬至幾十萬條探針與樣品進(jìn)行雜交，在一步試驗中獲取大量信息?？鼓[瘤藥物篩選專家講座第32頁2.基本技術(shù)路線①基因選擇與試驗設(shè)計

依據(jù)表示譜數(shù)據(jù)庫選擇5000-10000個與發(fā)育及疾病相關(guān)基因，制備藥品篩選芯片。②芯片制備抗腫瘤藥物篩選專家講座第33頁③細(xì)胞培養(yǎng)與藥品刺激

依據(jù)目標(biāo)藥品及表示譜芯片數(shù)據(jù)庫中細(xì)胞表示譜選擇適當(dāng)細(xì)胞系，用適當(dāng)計量藥品加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，不一樣時間取樣，抽提刺激前后mRNA。④大白鼠喂養(yǎng)與藥品刺激

用常規(guī)方法喂養(yǎng)大白