血清蛋白質(zhì)醋酸纖

血清蛋白質(zhì)醋酸纖1第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆针娪镜幕驹?，了解電泳儀﹑電泳槽的基本結(jié)構(gòu)與功能。熟悉電泳的基本過程與定量方法。熟悉血清電泳在臨床診斷中的作用。2第2頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日1、電泳（electrophoresis）法帶點(diǎn)粒子在直流電場(chǎng)中向著相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。3第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日電泳原理：在一定pH條件下，不同的質(zhì)點(diǎn)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們分離。影響電泳遷移率的外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大小和形狀4第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日常見的電泳技術(shù)：1.醋酸纖維膜電泳2.聚丙烯酰胺凝膠電泳3.瓊脂糖凝膠電泳4.等電聚焦電泳5.雙向電泳5第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維薄膜：將纖維素的羥基乙?；癁榇姿狨?，溶于丙酮后制成有均一細(xì)密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm6第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日7第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日優(yōu)點(diǎn)：1.吸附作用小2.電滲作用小3.

需加樣量少4.親水性小8第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日+白蛋白(A)α1α2βγ實(shí)驗(yàn)原理：血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥緩沖液中以負(fù)離子形式存在，并且蛋白質(zhì)的分子量、立體構(gòu)象、等電點(diǎn)以及形狀也有差異，在電場(chǎng)中遷移速度不同，可以在醋酸纖維薄膜上分離成A、α1、α2、β和γ五條區(qū)帶。蛋白名稱等電點(diǎn)分子量白蛋白4.8869000α5.06α1：20000α2：30000β5.1290000-150000γ6.85-7.50156000-3000009第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日三、實(shí)驗(yàn)器材1.電泳儀：為電泳提供直流電源。2.電泳槽：為電泳提供場(chǎng)所。多用有機(jī)玻璃制成，電極用鉑絲。3.血清加樣器：可用蓋玻片或X膠片或微量加樣器。4.醋酸纖維素薄膜：2cm×8cm5.其它：培養(yǎng)皿（直徑9-10cm）、濾紙、玻璃板、鑷子等。DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽10第10頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)試劑巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6、I=0.06)氨基黑10B染色液：氨基黑10B0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重復(fù)使用）。漂洗液：甲醇45ml、冰醋酸5ml和蒸餾水50ml，混勻。11第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)操作流程薄膜的準(zhǔn)備電泳槽的準(zhǔn)備點(diǎn)樣電泳染色與漂洗脫色

12第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日操作步驟：準(zhǔn)備：將巴比妥緩沖液加入電泳槽的電極室內(nèi)，使正負(fù)極室的液面等高，電泳支架寬度正好適合醋纖薄膜的長(zhǎng)度，用四層紗布或?yàn)V紙做鹽橋，一端浸入緩沖液中，一端搭在支架上。膜的預(yù)處理：將薄膜切成2×8cm，先于膜條無光澤面距一端1.5cm處用鉛筆輕劃一直線(點(diǎn)樣線)，再將薄膜無光澤面向下浸泡于巴比妥緩沖液中，浸透為止（30min)。取充分浸透的膜條，將薄膜無光澤面向上，濾紙吸取多余的緩沖液，不要吸太干。13第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日3.加樣：用滴管吸取待測(cè)血清一滴于玻璃片上，用點(diǎn)樣器末端處蘸取少許樣品，垂直輕印（迅速均勻）到薄膜點(diǎn)樣線上，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線。

此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵：以印章法加樣時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄破或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。點(diǎn)樣前可先在濾紙上反復(fù)練習(xí)，掌握點(diǎn)樣技術(shù)后再正式點(diǎn)樣。

14第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日4.平衡：待血清滲入薄膜后，將膜條無光澤面向下置于電泳槽支架上，點(diǎn)樣端靠近負(fù)極，薄膜兩端要緊貼濾紙（點(diǎn)樣線不要壓在濾紙上），中間平直懸空，加蓋密封，平衡5分鐘。5.電泳：將電泳槽正負(fù)極分別與電源正負(fù)極接好。開啟電源，調(diào)節(jié)電流密度為0.5mA/cm，如有10條寬2cm的膜條，其總寬度為20cm，應(yīng)使用電流強(qiáng)度為20cm×0.5mA/cm＝10mA。電壓15V/cm。通電50分鐘左右，關(guān)閉電源。6.染色和漂洗：取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色5分鐘后取出，先用自來水漂洗1-2次，然后用漂洗液漂洗3～4次，至背景完全無色為止。15第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日7.定量（1）洗脫比色：將各蛋白質(zhì)區(qū)帶仔細(xì)剪下，分置各試管中，另從空白背景剪塊平均大小的膜條置于空白管中。各管加入0.4mol/lNaOH4ml,于37℃水浴20分鐘（不時(shí)振蕩），待顏色脫凈即用波長(zhǎng)620nm比色，以空白管調(diào)零讀取各管吸光度。（2）計(jì)算:

吸光度總和（T）=A+α1+α2+β+γ（吸光度）

16第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日

血清蛋白組分的相對(duì)百分?jǐn)?shù)：A%=A/T×100%T—吸光度總和α1%=α1/T×100%α2%=α2/T×100%β%=β/T×100%

γ%=γ/T×100%17第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日

(1)醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。為防止指紋污染，取膜時(shí)應(yīng)戴指套或用夾子。所選薄膜應(yīng)厚薄均勻，否則應(yīng)棄去不用，以免造成電泳區(qū)帶扭曲，界線不清，背景脫色困難，結(jié)果難以重復(fù)。由于薄膜吸水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量緩沖液，并使其恢復(fù)到原來多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，最好讓薄膜吸滿緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上聚集的小泡趕走。點(diǎn)樣時(shí)薄膜上的緩沖液不宜太多，但也不能太干。注意事項(xiàng):18第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日(2)緩沖液的選擇

本實(shí)驗(yàn)常用的pH8．6巴比妥緩沖液，其濃度為0.05～O.09mol／L。選用何種濃度與樣品及薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動(dòng)速度快，并由于擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動(dòng)速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨。19第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日(3)加樣量

加樣品量的多少與電泳條件、樣品性質(zhì)、染色方法與檢測(cè)手段靈敏度密切相關(guān)。作為一般原則，檢測(cè)方法越靈敏，加樣量越少，對(duì)分離更有利。如加樣量過大，則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至相互干擾，染色也較費(fèi)時(shí)。3.點(diǎn)樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄破或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。20第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日注意事項(xiàng)市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。若飄浮于液面的薄膜在15～30s內(nèi)迅速潤(rùn)濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥－巴比妥鈉緩沖液，其濃度為0.05～0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動(dòng)速度快區(qū)帶擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動(dòng)速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴(kuò)散。但不宜太干，否則樣品不易進(jìn)入膜內(nèi)，造成點(diǎn)樣起始點(diǎn)參差不起，影響分離效果點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果電泳時(shí)應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為0.4～0.6mA/cm膜寬度。電流強(qiáng)度高，則熱效應(yīng)高；電流過低，則樣品泳動(dòng)速度慢且易擴(kuò)散操作過程為防止指紋污染，應(yīng)戴手套21第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日臨床意義：血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳，通常可分離白蛋白(Alb)、α1、α2、β和γ-球蛋白五個(gè)組分，正常人血清中各種蛋白質(zhì)濃度的差別較大，所以在許多疾病時(shí)僅表現(xiàn)出輕微變化，往往沒有特異的臨床診斷價(jià)值。分析幾種疾病的電泳分析結(jié)果，可以看出較顯著的變化。22第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日典型異常血清蛋白電泳圖譜在異常電泳圖譜中，腎病綜合征、肝硬化和多發(fā)性骨髓瘤(M蛋白血癥型)最具有特征性，在臨床上診斷意義最大。23第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期日幾種疾病的蛋白電泳變化

病名白蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白腎病↓↓↑↑↑↑↓彌溫性肝損害↓↓↑↓↓↑肝硬化↓↓↓↓β-γ橋原發(fā)性肝癌↓↓AFP↑多發(fā)性骨髓瘤↑↑↑慢性炎癥↓↑↑↑妊娠↓↑↓無丙