豬偽狂犬病的PCR診療專家講座

試驗(yàn)七豬偽狂犬病PCR診療豬偽狂犬病的PCR診療第1頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：1、了解PCR反應(yīng)原理、方法及操作步驟；2、掌握豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)方法；試驗(yàn)內(nèi)容：1、講述PCR反應(yīng)原理、方法及操作步驟，2、豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)。豬偽狂犬病的PCR診療第2頁(yè)什么是PCR？聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡(jiǎn)稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。一、PCR反應(yīng)原理、方法及操作步驟豬偽狂犬病的PCR診療第3頁(yè)P(yáng)CR原理PCR是一個(gè)選擇性擴(kuò)增DNA或RNA方法，其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中DNA半保留復(fù)制機(jī)理，以及在體外DNA分子于不一樣溫度下雙鏈和單鏈能夠相互轉(zhuǎn)變性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈；單鏈DNA與人工合成引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。高溫變性，低溫退火，適溫延伸等３步反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，使目標(biāo)DNA得以快速擴(kuò)增。豬偽狂犬病的PCR診療第4頁(yè)P(yáng)CR原理PCR技術(shù)在模板DNA、dNTP、Mg2+、適當(dāng)Buffer等條件下，用耐熱Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結(jié)合（復(fù)性）和延伸3個(gè)步驟重復(fù)循環(huán)（2530次）過程，使目標(biāo)DNA呈指數(shù)擴(kuò)增。豬偽狂犬病的PCR診療第5頁(yè)反應(yīng)程序變性：93-94℃2min變性：93-94℃30s復(fù)性：55-65℃30s延伸：72℃30s延伸：72℃2min35個(gè)循環(huán)豬偽狂犬病的PCR診療第6頁(yè)P(yáng)CR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension豬偽狂犬病的PCR診療第7頁(yè)P(yáng)CRproduct豬偽狂犬病的PCR診療第8頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul豬偽狂犬病的PCR診療第9頁(yè)豬偽狂犬病的PCR診療第10頁(yè)酶及其濃度當(dāng)前有兩種TaqDNA聚合酶供給天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個(gè)經(jīng)典PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)）濃度過高可引發(fā)非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量降低豬偽狂犬病的PCR診療第11頁(yè)引物引物是PCR特異性反應(yīng)關(guān)鍵PCR產(chǎn)物特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增豬偽狂犬病的PCR診療第12頁(yè)引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)址：/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi豬偽狂犬病的PCR診療第13頁(yè)豬偽狂犬病的PCR診療第14頁(yè)豬偽狂犬病的PCR診療第15頁(yè)P(yáng)CR產(chǎn)物分析凝膠電泳分析法

可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小。同時(shí)應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量作平行對(duì)照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測(cè)儀下觀察結(jié)果并拍照。豬偽狂犬病的PCR診療第16頁(yè)二豬偽狂犬病毒感染PCR檢測(cè)-試劑盒豬偽狂犬病的PCR診療第17頁(yè)豬偽狂犬病的PCR診療第18頁(yè)使用方法豬偽狂犬病的PCR診療第19頁(yè)注意