中藥與制藥微生物學(xué)實驗

目的要求:1、了解微生物學(xué)實驗室常用消毒滅菌儀器設(shè)備

2、了解空氣、皮膚細菌檢查方法

3、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法實驗一藥品的微生物限度檢查（一）實驗室常用消毒滅菌設(shè)備空氣和皮膚細菌檢查方法目前一頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點一.藥品的微生物限度檢查（一）1.口服藥物的微生物檢查:①大腸桿菌的檢查：②細菌總數(shù)的檢查2.外用藥物的微生物檢查:①綠膿桿菌的檢查：②金黃色葡萄球菌的檢查：

目前二頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點口服藥外用藥藥品的微生物限度檢查實驗方法（一）

1.藥品的預(yù)處理2克藥品加20毫升生理鹽水，研磨制成懸液

2.細菌培養(yǎng)外服藥口用藥藥品混懸液10毫升加入膽鹽乳糖增菌液中藥品混懸液10毫升加入膽鹽乳糖增菌液中藥品混懸液10毫升加入亞碲酸鈉增菌液中37℃,24小時37℃,24小時目前三頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點

將剩余口服藥以10-110-210-310-4

進行稀釋(以生理鹽水稀釋)

3.細菌總數(shù)測定加溶化的瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，冷卻后,置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時

。取三個中試管各管加9ml生理鹽水從剩余10ml懸液中取1ml加入第一個稀釋管中1ml10-110-410-210-39ml生理鹽水從上述三個稀釋管中各取1ml1ml10-110-410-210-3目前四頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點二.空氣、皮膚細菌檢查方法(驗證)三.微生物學(xué)實驗室常用消毒滅菌儀器設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋消毒煮沸器G6玻璃濾菌器裝置潔凈工作臺移動式紫外光燈鼓風(fēng)式干烤箱紫外線殺菌標(biāo)本。目前五頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點厭氧工作站催化劑（鈀粒）厭氧培養(yǎng)罐電熱恒溫培養(yǎng)箱二氧化碳培養(yǎng)箱目前六頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點一、目的要求:1、了解細菌培養(yǎng)接種技術(shù)

2、掌握細菌基本形態(tài)

3、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容1.藥物的微生物限度檢查（二）2.空氣、皮膚細菌檢查結(jié)果測定。3.講授基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法（營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯）。4.培養(yǎng)基的種類和用途普通培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基5.細菌在三種不同物理性狀培養(yǎng)基上的接種方法(基本技能)

液體培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基 雙糖含鐵半固體斜面培養(yǎng)基6.顯微鏡下觀察

細菌的基本形態(tài):球菌、枯草桿菌、霍亂弧菌。特殊結(jié)構(gòu)：肺炎莢膜、變形鞭毛、破傷風(fēng)芽胞。實驗二藥品的微生物限度檢查（二）細菌的形態(tài)學(xué)檢查及培養(yǎng)接種技術(shù)目前七頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點一、空氣、皮膚的細菌檢查結(jié)果

1、記錄空氣微生物培養(yǎng)結(jié)果（要記錄本人所在實驗臺的結(jié)果）菌落大小、邊緣、顏色、粗糙（光滑）2、記錄皮膚微生物培養(yǎng)結(jié)果（要記錄本人的實驗結(jié)果）比較消毒前后細菌菌落數(shù)，菌落特點。目前八頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點二、培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基分類根據(jù)物理性狀分類：液體培養(yǎng)基主要用于增菌半固體培養(yǎng)基用于檢測動力及保存菌種固體培養(yǎng)基用于分離鑒定細菌根據(jù)用途分類：基礎(chǔ)培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基SS培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基雙糖鐵培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基庖肉培養(yǎng)基目前九頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點培養(yǎng)基的制備程序調(diào)配→矯正pH（）→分裝→滅菌（121.3℃，20-30分鐘）→放入冰箱冷藏備用。因高壓之后pH值會下降0.1左右，所以矯正pH時應(yīng)比所需的pH高。鑒定是否有菌可將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)24小時，然后觀察。目前十頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點方法1.平板劃線接種法（1）平行劃線法（2）分區(qū)劃線法2.瓊脂斜面的接種方法3.液體培養(yǎng)基接種法4.半固體接種法目前十一頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點平行劃線法目前十二頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點分區(qū)劃線法目前十三頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點菌落目前十四頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點斜面移種技術(shù)目前十五頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點菌苔目前十六頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點液體移種技術(shù)目前十七頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點穿刺技術(shù)目前十八頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點取出前次實驗培養(yǎng)物觀察：

1.口服藥物1)細菌鑒定：在膽鹽乳糖增菌液中有無細菌生長：增菌液變混濁―――――有

-----接種在伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上面。方法：分區(qū)劃線接種。

2)細菌總數(shù)測定：選擇30-300個菌落平板，細菌總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)藥物的微生物限度檢查方法（二）目前十九頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點2.外用藥1)判定膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物及亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物有無細菌生長：增菌液變混濁―――有2)細菌鑒定：（1）將膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物無菌接種在16烷三甲基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基上面。方法：斜面化線接種；（2）將亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物，無菌接種在卵黃高鹽瓊脂平板培養(yǎng)基上面。方法：分區(qū)劃線接種。

37℃恒溫孵育箱24小時培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。目前二十頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點細菌基本形態(tài)球菌桿菌螺形菌目前二十一頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點葡萄球菌目前二十二頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點鏈球菌目前二十三頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點大腸埃希菌目前二十四頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點枯草桿菌目前二十五頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點霍亂弧菌目前二十六頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點細菌特殊結(jié)構(gòu)鞭毛莢膜芽孢目前二十七頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點破傷風(fēng)梭菌spore目前二十八頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點一、目的要求:1、了解細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察

2、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容1.藥物的微生物限度檢查（三）2.細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察

1）液體培養(yǎng)基---沉淀、渾濁、表面生長現(xiàn)象。

2）三葡、三鏈、大腸與副傷乙培養(yǎng)基的菌落特征、溶血環(huán)觀察。

3）雙糖含鐵培養(yǎng)基---動力、氣體、硫化氫、分解乳糖觀察。

4）結(jié)核桿菌菌落的觀察。 3.中草藥、抗生素抑菌試驗

1）中草藥---大蒜汁、黃連、黃芩、黃柏。

2）抗生素---青霉素、慶大、氨芐、新諾明、生理鹽水。實驗三藥品的微生物限度檢查（三）微生物的形態(tài)學(xué)檢查及藥物的敏感性試驗?zāi)壳岸彭揬總數(shù)六十六頁\編于十六點1）從伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上-----

挑取黑色帶有金屬光澤的濕潤菌落，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面，進行細菌的純培養(yǎng)。

2）觀察外用藥物在16烷三甲基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長狀況。記錄被檢菌色素的溶解性質(zhì)、液化明膠的狀況及菌苔粘稠度等。

革蘭氏染色鏡下觀察其菌落形態(tài)。根據(jù)上述被檢菌落的生物性質(zhì)和狀況及細菌形態(tài)，確定該被檢菌的名稱。

3）從卵黃高鹽瓊脂平板培養(yǎng)基上生長，挑取黃色的濕潤菌落，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面，進行細菌的純培養(yǎng)。藥物的微生物限度檢查（三）目前三十頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點2.細菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察混濁生長菌膜菌沉淀均勻渾濁對照目前三十一頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點菌膜生長目前三十二頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點目前三十三頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點目前三十四頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點目前三十五頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點腸道桿菌雙糖鐵培養(yǎng)基結(jié)果比較目前三十六頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點革蘭染色步驟

1.制片：取標(biāo)本（球桿混合物、牙垢）涂片、干燥、固定2.初染：結(jié)晶紫——1min——水洗3.媒染：碘液——1min——水洗4.脫色：95%酒精——30s——水洗5.復(fù)染：沙黃——1min—水洗、濾紙吸干6.油鏡觀察：目前三十七頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點目前三十八頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點1、制片

涂片、干燥、固定目前三十九頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點2.結(jié)晶紫初染1min——水洗目前四十頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點3.碘液媒染1min——水洗目前四十一頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點4.95%酒精脫色30s——水洗目前四十二頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點5.沙黃復(fù)染1min——水洗、濾紙吸干目前四十三頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點目前四十四頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點6.油鏡觀察

結(jié)果革蘭陽性菌：紫色革蘭陰性菌：紅色目前四十五頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點3.中草藥、抗生素抑菌試驗?zāi)壳八氖揬總數(shù)六十六頁\編于十六點紙片法目前四十七頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點實驗四藥物的微生物限度檢查（四）病毒和細菌及其他病原微生物一、目的要求1、了解抗酸染色方法及各種病毒和細菌的菌落形態(tài)2、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗程序和方法二、實驗內(nèi)容1、藥物的微生物限度檢查（四）1）將口服藥物中的細菌分別接種：①蛋白胨水培養(yǎng)基；②葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；③枸櫞酸鹽（西蒙氏）培養(yǎng)基。同時接種產(chǎn)氣桿菌于上述培養(yǎng)管做對照，以備進行IMViC試驗。2）取接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面的外用藥物中細菌進行血漿凝固酶檢測,依據(jù)其反應(yīng)結(jié)果,確定該菌的性質(zhì)及名稱。2、抗酸染色 3、真菌培養(yǎng)物的觀察------黑曲霉、木霉、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌絲，酵母菌菌落的觀察。4、記錄中草藥、抗生素抑菌試驗結(jié)果5、觀察雞胚的結(jié)構(gòu) 目前四十八頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點接種細菌的對應(yīng)生化反應(yīng)管目前四十九頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點血漿凝固酶試驗

玻片法目前五十頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點抗酸染色原理:結(jié)核分枝桿菌含脂質(zhì)多,不易著色,若加溫或延長時間使其著色后,再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色,稱抗酸染色.經(jīng)此染色后,結(jié)核分枝桿菌呈紅色,其它呈藍色.

步驟２．抗酸染色目前五十一頁\總數(shù)六十六頁\編于十六點制片（涂片、干燥、固定）；石炭酸復(fù)紅初染（加熱、蓋濾紙片）5min---水洗；3％鹽酸酒精脫色（15S,水洗）；美蘭復(fù)染（1min，水洗