乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查

乙型病毒性肝炎試驗(yàn)室檢驗(yàn)匯報(bào)人：付紅偉天津醫(yī)大總醫(yī)院檢驗(yàn)中心.1.21乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查1/37我國(guó)HBV感染概況普通人群HBsAg攜帶率高達(dá)7.18%；現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬(wàn)人，占全世界1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超出

2000萬(wàn)例，占全世界慢性乙肝患者1/3；15歲以下兒童HBsAg攜帶率下降顯著，1-4歲組僅為0.96%；1~4歲組HBsAb陽(yáng)性率由1992年15.75%升至72.25%;抗HBcAb陽(yáng)性率由1992年30.08%降至3.76%；2乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查2/37HBV基因組HBVDNA是由長(zhǎng)鏈L(負(fù)鏈)

和短鏈S(正鏈)

組成不完全雙鏈環(huán)狀DNA，短鏈長(zhǎng)度相當(dāng)于長(zhǎng)鏈50%～85%。HBVDNA長(zhǎng)鏈載有病毒蛋白質(zhì)全部密碼，有4個(gè)開(kāi)放讀碼框架(ORF)，分別稱為S、C、P和X區(qū)。編碼7個(gè)蛋白質(zhì)。HBVDNA易發(fā)生變異，尤其是前S或S區(qū)基因較易突變。嗜肝DNA病毒共同特點(diǎn)：內(nèi)含3~3.3kb渙散環(huán)狀、部分雙鏈DNA基因組及DNA聚合酶；病毒復(fù)制需逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。3乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查3/37HBV抗原和抗體系統(tǒng)表面抗原(HBsAg)：HBV外膜糖蛋白=S+L+M蛋白

S蛋白：狹義HBsAg指S蛋白。HBsAg陽(yáng)性說(shuō)明機(jī)體有HBV感染。中分子蛋白：preS2+S

大分子蛋白：preS1+preS2+SS蛋白中分子蛋白大分子蛋白PreS1PreS2S1.HBsAg和抗-HBs乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查4/37e抗原(HBeAg)：是可溶性蛋白質(zhì)只存在于血液中是病毒復(fù)制和傳染性標(biāo)志e抗體(抗-HBe)：對(duì)HBV感染有一定保護(hù)作用其出現(xiàn)標(biāo)志著病毒復(fù)制降低、傳染性降低前C區(qū)C區(qū)前C/C蛋白HBeAgHBcAg表示切割、加工HBeAg只存在于血清中HBVC基因分泌到細(xì)胞外2.HBeAg和抗-HBe5乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查5/37HBV三種形態(tài)1,HepatitisBvirion(Daneparticle)2,secretedfilament3,secretedsphere6乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查6/377HBV自然復(fù)制周期乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查7/378生物化學(xué)檢測(cè)1HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)2HBV分子生物學(xué)診療3HBV臨床藥品療效檢測(cè)4HBV感染試驗(yàn)室檢驗(yàn)乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查8/371.乙型肝炎生物化學(xué)檢測(cè)主要指標(biāo)：ALT,AST,ASTm，血清白蛋白，血清膽紅素，膽堿酯酶,甲胎蛋白,凝血酶原時(shí)間(PT)及部分凝血因子；9乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查9/37方法學(xué)發(fā)展ELISA：靈敏性高，成本低，適合用于普通病人篩查；膠體金免疫層析法(金標(biāo)法)：簡(jiǎn)便易行，可用于急診病人快速檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)：價(jià)格昂貴，可用于HBVMs為臨界值病人確實(shí)證；可間接反應(yīng)宿主HBV復(fù)制水平，在評(píng)價(jià)抗病毒治療病毒學(xué)應(yīng)答、療效和判斷預(yù)后方面有主要意義。新增檢測(cè)指標(biāo)Pre–S1、Pre–S2及其對(duì)應(yīng)抗體對(duì)乙肝兩對(duì)半新認(rèn)識(shí)102.HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查10/3711HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)方法成本效果分析(1)乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查11/3712HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)方法成本效果分析(2)Back乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查12/3713Terminal

proteinSpacerReverse

Transcriptase

(RT)RNaseHrt1rt344preS1preS2Ss1s266HBsAg乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查13/37XMutationofS&Pre-SS基因“a”決定簇

G145R

變異，與抗-HBs親和力降低S基因變異可造成隱匿性HBV感染(occultHBVinfection)，表現(xiàn)為血清HBsAg陰性，但仍可有HBV低水平復(fù)制(血清HBVDNA常<104拷貝/ml)獻(xiàn)血員人群，隱匿性HBV感染檢出率可達(dá)0.19%14乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查14/3715乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查15/3716Pre–S1檢測(cè)臨床價(jià)值前S1蛋白主要存在于Dane顆粒和管型顆粒上，在HBV感染宿主細(xì)胞過(guò)程及在病毒復(fù)制和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)中起主要作用;前S1抗原與HBeAg之間有高度相關(guān)性，并可區(qū)分因變異種及其它原因造成乙肝病毒e抗原(HBeAg)假陰性，可作為HBeAg假陰性補(bǔ)充，從而準(zhǔn)確反應(yīng)患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況；可作為HBV感染及復(fù)制標(biāo)注，與其它血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，相互補(bǔ)充。Back乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查16/3717HBeAg陰性的慢乙肝患者，肝硬化年發(fā)生率8%-10%；HBeAg陽(yáng)性的慢乙肝患者，肝硬化年發(fā)生率2%-5%對(duì)HBeAg陰性患者應(yīng)該開(kāi)展更積極的治療大三陽(yáng)小三陽(yáng)vs乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查17/37HBV血清學(xué)標(biāo)志檢測(cè)結(jié)果分析16乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查18/3719類型HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb樣本數(shù)(n)組成比(%)1＋－－－＋40.212＋－＋－＋231.203＋－－＋＋985.114－－－－＋462.405－－－＋＋683.556－＋－＋＋1849.607－＋－－＋633.298－＋－－－47024.539－－－－－96050.10累計(jì)1257172335048619161001916例HBV血清標(biāo)志物陽(yáng)性類型分布模式乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查19/3720乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查20/3721乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查21/3722HBVDNA定量檢測(cè)病毒復(fù)制水平最可靠，最直接證據(jù)，與傳染性和疾病進(jìn)展親密相關(guān)；主要用于HBV感染判斷，治療適應(yīng)癥選擇及抗病毒療效判斷。HBV基因分型基因分型必要性；基因分型主要方法；HBV耐藥突變檢測(cè)3.HBV分子生物學(xué)診療乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查22/37慢性HBV感染治療適應(yīng)癥選擇HBeAg陽(yáng)性，HBVDNA載量>105copies/ml,ALT>2×ULN;HBeAg陰性，HBVDNA載量>104copies/ml,ALT>2×ULN;HBVDNA連續(xù)陽(yáng)性，年紀(jì)>40歲，ALT大于正常上限，也可給予抗病毒治療；HBVDNA連續(xù)陽(yáng)性，年紀(jì)>40歲，ALT連續(xù)正常，應(yīng)親密隨訪，動(dòng)態(tài)觀察疾病進(jìn)展，必要時(shí)行肝組織檢測(cè)，有病變證據(jù)時(shí)，能夠給予抗病毒治療；23乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查23/37HBV感染抗病毒治療療效評(píng)定治療終點(diǎn)：HBVDNA顯著下降或低于檢測(cè)下限，并伴有ALT正常；HBVDNA水平治療開(kāi)始后3個(gè)月內(nèi)連續(xù)下降1log以上才說(shuō)明治療有效；每日0.5mg恩替卡韋治療1年時(shí),HBeAg陽(yáng)性和陰性慢性乙型肝炎患者HBVDNA檢測(cè)不到率分別為67%和90%,恩替卡韋HBeAg轉(zhuǎn)換率為21%,與其它口服抗病毒藥相同。并不以HBeAg轉(zhuǎn)陰或HBsAg轉(zhuǎn)陰為治療終點(diǎn)或目標(biāo)。24乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查24/37HBVDNA定量檢測(cè)試劑盒性能對(duì)比25乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查25/3726同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)HCV,HIV-1,衣原體，及淋病一體化檢測(cè)Back乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查26/37病毒基因突變疾病進(jìn)展臨床表現(xiàn)對(duì)干擾素應(yīng)答耐藥變異生化學(xué)改進(jìn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換HBVDNA去除急性乙型肝炎慢性乙型肝炎肝硬化(LC)肝細(xì)胞癌(HCC)27HBV基因型/基因亞型乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查27/37分型方法優(yōu)缺點(diǎn)序列測(cè)定法最直接，最可信，是HBV基因分型金標(biāo)準(zhǔn)，但繁瑣費(fèi)時(shí)而且價(jià)格昂貴，混合型檢測(cè)能力差，不適于大樣本檢測(cè)。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)較測(cè)序法簡(jiǎn)便，適于大樣本檢測(cè)，但因?yàn)樾枰M(jìn)行酶切，所以操作仍較為繁瑣，成本較高，并存在酶切不徹底等問(wèn)題。pre-S2單克隆抗體酶聯(lián)免疫測(cè)定(mAbsEIA法)簡(jiǎn)單、快速，已商品化，適于大樣本檢測(cè)，但檢測(cè)費(fèi)用較高并不能有效判別有些混合型感染和HBsAg低表示及一些表位表示不充分標(biāo)本。分子探針雜交法簡(jiǎn)單、快速，對(duì)混合型檢測(cè)非常敏感，已商品化，適于大樣本檢測(cè)，但檢測(cè)費(fèi)用較高而且靈敏度和特異度還有待提升。型特異性引物PCR法簡(jiǎn)單、快速，成本低，含有較高靈敏度，適于流行病學(xué)研究和臨床大樣本檢測(cè)。但特異度還有待提升。慣用HBV基因分型方法比較28乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查28/37B型特異性“引物對(duì)”特異度分析B型特異性引物HB（正義鏈）：5’-ACCGTGAACGCCCACMGGAA-3’29Back乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查29/374.HBV臨床藥品治療監(jiān)測(cè)乙肝病毒耐藥性檢測(cè)，是精準(zhǔn)治療乙肝關(guān)鍵??！當(dāng)前因?yàn)橹委煵粔蛞?guī)范，造成我國(guó)當(dāng)前超出95%乙肝患者發(fā)生耐藥、病毒變異、病毒耐藥，變異檢測(cè)勢(shì)在必行！拉米夫定是第一個(gè)被同意治療慢性乙型肝炎口服抗病毒藥,已在全世界廣泛應(yīng)用。但其耐藥發(fā)生率高,治療1年時(shí)耐藥發(fā)生率為23%,2年為46%,3年為55%,4和5年分別為65%和71%。30乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查30/37耐藥---核苷(酸)類似物(NA)治療失敗最主要原因31拉米夫定LMV阿德福韋酯ADV替比夫定LdT恩替卡韋ETVHBV替諾福韋TDVNAs：抑制病毒復(fù)制長(zhǎng)久使用耐藥變異乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查31/37臨床耐藥表型耐藥基因耐藥耐藥研究32乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查32/3733乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查33/3734PolymeraseTerminal

proteinSpacerReverse

Transcriptase

(RT)RNaseHrt1rt344逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)一些位點(diǎn)變異與耐藥相關(guān)preS1preS2HBsAgs1s266可同時(shí)分析：耐藥變異，HBsAg變異，基因型，血清型乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查34/37全長(zhǎng)RT區(qū)分析技術(shù)路線HBVDNA提取snPCR擴(kuò)增RT區(qū)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序生物信息學(xué)分析與數(shù)據(jù)