角化細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展

角化細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展第1頁/共30頁角化細(xì)胞(KC)培養(yǎng)研究進(jìn)展第2頁/共30頁提綱KC來源及分化過程KC的作用KC培養(yǎng)方法

滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)無滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)影響KC培養(yǎng)的的因素

霍亂毒素(CT)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和鈣離子(Ca2+)第3頁/共30頁一、KC來源及分化過程第4頁/共30頁KC來源及分化過程皮膚主要由表皮和真皮組成，中間由基底膜隔開；表皮由上至下分別為角質(zhì)層、顆粒層、棘層和基底層；KC主要來源于基底層。1.皮膚結(jié)構(gòu)和KC來源第5頁/共30頁KC來源及分化過程表皮干細(xì)胞定向祖細(xì)胞終末分化KC凋亡KC10-14d干細(xì)胞含量較少，通常處于靜息狀態(tài)，分裂緩慢，短時(shí)間獲取大量干細(xì)胞難度大；而定向祖細(xì)胞具有分化潛能且分裂較快的優(yōu)點(diǎn)。橋粒和角化包膜形成2.KC分化過程第6頁/共30頁二、KC的作用第7頁/共30頁KC的抗菌作用1.KC通過PRR識(shí)別病原體Kollisch等(2005)用RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)KC可表達(dá)不同的TLR亞型。PGN、poly(I:C)和flagelli可分別與KC的TLR2、TLR3和TLR5結(jié)合，從不同程度刺激KC分泌IL-8說明KC可通過TLR識(shí)別細(xì)菌上的病原相關(guān)分子模式(PAMP)，分泌IL-8等物質(zhì)清除病原體。第8頁/共30頁KC的抗菌作用2.KC分泌AMP殺滅病原體Glaser等(2005)用抗菌測(cè)試試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗菌肽S100A7可特異性的殺死大腸桿菌。ONG等(2005)研究發(fā)現(xiàn)LL-37能有效殺滅葡萄球菌。KC在抵抗外來微生物入侵中的另一個(gè)重要作用是產(chǎn)生大量的AMP。陽離子抗菌肽主要有LL-37、防御素和S100蛋白家族(HarderandSchroder,2005)。第9頁/共30頁三、KC的培養(yǎng)方法第10頁/共30頁KC培養(yǎng)最早始于1967年(Briggaman等，1967)，隨后人們陸續(xù)培養(yǎng)出鼠(Marvin等，1971)、兔(Liu等，1978)和狗(Wilkinson等，1987)等的KC。使用的培養(yǎng)方法包括滋養(yǎng)層培養(yǎng)法和無滋養(yǎng)層培養(yǎng)法。第11頁/共30頁滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)1.以3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層1975年，Rheinwald等首次成功地在體外連續(xù)培養(yǎng)人正常KC。

他們把射線滅活的鼠3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，將胰蛋白酶消化后的單個(gè)KC接種于其上，發(fā)現(xiàn)KC能明顯抑制3T3細(xì)胞，且自身生長(zhǎng)良好，并將3T3滋養(yǎng)層細(xì)胞不斷推至培養(yǎng)皿邊緣。圖中紅色為KC，藍(lán)色為3T3細(xì)胞第12頁/共30頁滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)1.以3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層Alain等(1986)用3T3滋養(yǎng)層培養(yǎng)法成功培養(yǎng)了人頭皮毛囊KC。5d18d第13頁/共30頁滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)2.以成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層Alain等(1989)首先介紹了用自體成纖維細(xì)胞代替3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，成功培養(yǎng)了人頭皮毛囊KC。真皮成纖維細(xì)胞絲裂霉素C或射線有絲分裂后細(xì)胞成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層KC接種6d3weeks第14頁/共30頁滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞接種密度低、增殖速度較快、細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定；而且滅活的3T3細(xì)胞自身無生長(zhǎng)能力，有利于接種的KC生長(zhǎng)增殖。弊端：一反面可能會(huì)造成KC和3T3細(xì)胞的混合污染，另一方面存在著將3T3細(xì)胞DNA遺傳信息整合入增殖的KC內(nèi)的危險(xiǎn)。第15頁/共30頁無滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)Wilkinson等(1987)率先用無滋養(yǎng)層方法成功分離培養(yǎng)了狗KC。皮膚組織分離酶4℃孵育18h表皮KC培養(yǎng)、傳代20℃孵育45min特定培養(yǎng)基吸管吹吸第16頁/共30頁無滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)Hager等(1999)用無滋養(yǎng)層方法成功分離培養(yǎng)了小鼠KC，并將其傳至第19代，但只有前10代細(xì)胞具有分化能力。真皮膠原酶紗布過濾、離心混合細(xì)胞成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基HCMEMEM.06EMEM.06(1:1)KC培養(yǎng)基第17頁/共30頁無滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)Caldelari等(2000)在Wilkinson方法基礎(chǔ)上成功分離培養(yǎng)了17.5d小鼠胚胎KC，并在傳至第61代依然保持分化活性。17.5d小鼠胚胎皮膚分離酶definedkeratinocyte-SFM表皮KC培養(yǎng)、傳代剪碎胰酶消化definedkeratinocyte-SFM提高Ca2+濃度后，Keratin和E-cadherin表達(dá)呈陽性，且漿膜外形成排列緊密的角蛋白網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞間形成穩(wěn)定的連接結(jié)構(gòu)，說明細(xì)胞仍保持分化活力。第18頁/共30頁無滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)有學(xué)者認(rèn)為無滋養(yǎng)層培養(yǎng)的細(xì)胞缺少分化標(biāo)記物(中間絲蛋白、張力原纖維和橋粒)的表達(dá)(Prignano等，1999)；小鼠KC在培養(yǎng)30代后會(huì)出現(xiàn)非整倍型染色體。第19頁/共30頁四、影響KC培養(yǎng)的因素人為因素接種密度、傳代時(shí)間培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基、霍亂毒素(CT)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和鈣離子(Ca2+)

第20頁/共30頁影響KC培養(yǎng)的因素1.霍亂毒素(CT)CT是分子量為8400D的蛋白質(zhì)，由A和B兩個(gè)亞基組成。B亞基可將腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合到細(xì)胞表面，A亞基可激活腺苷酸環(huán)化酶。Green(1978)發(fā)現(xiàn)濃度為10-11-10-9M的CT均可有效促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。第21頁/共30頁影響KC培養(yǎng)的因素1.霍亂毒素(CT)說明當(dāng)細(xì)胞密度較低時(shí)，CT可提高cAMP濃度并促進(jìn)細(xì)胞增殖；當(dāng)細(xì)胞密度增高時(shí)，CT可降低cAMP濃度，從而抑制高密度細(xì)胞生長(zhǎng)。Natsuko等(1982)細(xì)胞密度較低時(shí)，CT可促進(jìn)DNA和蛋白質(zhì)合成；細(xì)胞密度增加后，CT抑制DNA和蛋白質(zhì)合成向培養(yǎng)基中加入濃度范圍為10-14-10-8M的CT后6h，可成百倍的提高胞內(nèi)cAMP濃度。③①②第22頁/共30頁影響KC培養(yǎng)的因素2.表皮生長(zhǎng)因子(EGF)EGF是分子量為6045D的多聚肽，最先由Cohen(1962)從鼠頜下腺中分離，并發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)新生小鼠表皮生長(zhǎng)和成熟的作用。Rheinwald等(1977)將EGF加入KC培養(yǎng)基后發(fā)現(xiàn)，EGF不僅可以促進(jìn)KC生長(zhǎng)，還能增加其壽命。第23頁/共30頁影響KC培養(yǎng)的因素2.表皮生長(zhǎng)因子(EGF)Wilkinson等(1987)也發(fā)現(xiàn)EGF可促進(jìn)狗KC增殖，而且EGF和CT具有協(xié)同效應(yīng)。第24頁/共30頁影響KC培養(yǎng)的因素2.表皮生長(zhǎng)因子(EGF)Miguel等(2001)的發(fā)現(xiàn)說明EGF主要通過提高端粒酶的活性來延緩細(xì)胞衰老。細(xì)胞每次分裂，端粒會(huì)縮短一點(diǎn)，當(dāng)端粒消耗完之后，細(xì)胞便會(huì)凋亡；而端粒酶可阻止端?？s短，也就是說端粒酶可延緩細(xì)胞凋亡。影響KC培養(yǎng)的因素3.鈣離子(Ca2+)Hennings等(1980)發(fā)現(xiàn)在低Ca2+濃度(0.09mM)中，KC以單層形式聚合，并形成“鋪路石”樣；在高Ca2+濃度(1.14mM)中時(shí)，KC會(huì)向垂直方向角化并形成4-5層細(xì)胞，隨后從培養(yǎng)皿上脫落，接種后5d，增殖細(xì)胞比例不到60%。0.09mMKC增殖1.14mMKC已分化最先被發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)受到鈣離子影響的細(xì)胞是鼠3T3細(xì)胞(Boynton等，1974)和人WI-38成纖維細(xì)胞(Boynton等，1977)。作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鈣離子濃度低于0.5mM時(shí)，這兩種細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制。第26頁/共30頁影響KC培養(yǎng)的因素3.鈣離子(Ca2+)Ca2+濃度小于0.3mM時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增多；大于0.3mM時(shí)，細(xì)胞數(shù)量減少。Ca2+濃度小于0.3mM時(shí)，含有角化包膜細(xì)胞比例較少；大于0.3mM時(shí)，含有角化包膜細(xì)胞比例增多。說明Ca2+濃度大于0.3mM時(shí)，Ca2+會(huì)抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞分化。Steven,等(1983)第27頁/共30頁影響KC培養(yǎng)的因素3.鈣離子(Ca2+)1，25-D3可通過誘導(dǎo)PLC-λ1表達(dá)來促進(jìn)involucrin和transglutaminase表達(dá)1，25-D3可通過誘導(dǎo)PLC-λ1表達(dá)來提升胞內(nèi)Ca2+濃度。說明1，25-D3可通過誘導(dǎo)PLC-λ1表達(dá)來提升胞內(nèi)Ca2+濃度，最后促進(jìn)involucrin和transglutaminase表達(dá)，引起細(xì)胞分化。Xie,等(2001）第28頁/共30頁影響KC培養(yǎng)的因素霍亂毒素(CT) 當(dāng)細(xì)胞密度較低時(shí)，CT可提高cAMP濃度并促進(jìn)