實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法

實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第1頁2、指示劑與染色劑

溴酚蘭二甲苯青溴化乙錠3、上樣緩沖液（loadingbuffer,6*,10*)

0.25%溴酚蘭

0.25%二甲苯青

30%甘油實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第2頁

溴化乙錠(Ethidiumbromide，EB）是一個熒光染料，這種扁平分子能夠嵌入核酸雙鏈配對堿基之間，在紫外激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。激發(fā)熒光能量來自兩個方面，一是核酸吸收波長為260nm紫外線后將能量傳給溴化乙錠，二是結(jié)合在DNA分子中EB本身，主要吸收波長為300nm和360nm紫外線能量，起源于這兩方面能量，最終激發(fā)EB發(fā)射出波長為590nm可見光譜紅橙區(qū)紅色熒光。EB-DNA復(fù)合物中EB發(fā)出熒光，比游離凝膠中EB本身發(fā)射熒光強(qiáng)度大10倍，所以不需要洗凈背景就能夠清楚地觀察到核酸電泳條帶，若核酸量少，而EB背景太深致使帶型不清，可將凝膠浸泡于1mmol/LMgSO4中1小時或10mmol/LMgCl2中5min,使非結(jié)合EB褪色，降低未結(jié)合EB產(chǎn)生背景熒光，這么能夠檢測到10ngDNA樣品。單鏈DNA,RNA分子中常存在本身配正確雙鏈區(qū)，也可嵌入EB分子，但嵌入量少，因而熒光較低，其最低檢出量為0.1ug.實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第3頁本制品是核酸電泳用LoadingBuffer。向電泳樣品溶液中加入1/6量即可上樣電泳。本制品中含有色素溴酚藍(lán)（BromophenolBlue)、二甲苯腈藍(lán)FF（XyleneCyanolFF)，能夠觀察電泳進(jìn)行情況。溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠（0.5%~1.4%）中約與300bp雙鏈線狀DNA遷移速度相同（在0.5×TBE中)，而二甲苯腈藍(lán)FF則與4kbp雙鏈線狀DNA遷移速度相等。溴酚藍(lán)與二甲苯腈藍(lán)FF在聚丙烯酰胺凝膠中遷移速率則隨凝膠濃度改變而不一樣。本緩沖液配制組成合理，緩沖液中不含核酸酶（DNase或RNase)，泳帶清楚，是試驗(yàn)室常見凝膠電泳上樣用緩沖液。普通來說，PCR反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳以及短鏈DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳時，常使用本制品。(DNA用)實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第4頁本制品是核酸電泳用LoadingBuffer。制品中含有SDS，可即刻停頓各種酶促反應(yīng)。使用時向酶促反應(yīng)液中加入1/10量本制品，即可上樣電泳。本制品中含有色素溴酚藍(lán)（BromophenolBlue)，能夠觀察電泳進(jìn)行情況。溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠（0.5%~1.4%）中約與300bp雙鏈線狀DNA遷移速度相同（在0.5×TBE中)。本緩沖液配制組成合理，緩沖液中不含核酸酶（DNase或RNase)，尤其適合用于各種酶促反應(yīng)停頓以及各種酶促反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳。普通來說，各種限制酶、修飾酶酶促反應(yīng)后電泳時，常使用本制品。(DNA用)實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第5頁10×LoadingBuffer(RNA電泳用)

組份濃度配制量10ml配制方法稱量以下試劑，置于10ml離心管中。

2.向離心管中加入約4mlDEPC處理水后，充分?jǐn)嚢枞芙狻?.加入5ml甘油（Glycerol）后，充分混勻。4.用DEPC處理水定容至10ml后，室溫保留。實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第6頁4、電泳緩沖液(10*)TAETBETPE50×TAEBuffer(pH8.5)

組份濃度2MTris-醋酸,100mMEDTA配制量1L配制方法稱量以下試劑，置于1L燒杯中。

2.向燒杯中加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?.加入57.1ml醋酸，充分?jǐn)嚢琛?.加去離子水將溶液定容至1L后，室溫保留。實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第7頁10×TBEBuffer(pH8.3)

組份濃度配制量配制方法10×MOPSBuffer

組份濃度200mMMOPS,20mMNaOAc,10mMEDTA配制量1L配制方法1.稱量41.8gMOPS，置于1L燒杯中。2.加約700mlDEPC處理水，攪拌溶解。3.使用2NNaOH調(diào)整pH值至7.0。4.再向溶液中加入以下試劑。5.用DEPC處理水將溶液定容至1L。6.用0.45mm濾膜過濾除去雜質(zhì)。7.室溫避光保留。注：溶液見光或高溫滅菌后會變黃。變黃時也可使用，但變黑時不要使用。實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第8頁凝膠膠濃度（％）線性DNA大小PAG3.5100-bpPAG580-500PAG860-400PAG1240-200PAG206-100agarose0.35-60kbagarose0.61-20agarose0.70.8-10agarose0.90.5-7agarose1.20.4-6agarose1.50.2-4agarose2.00.1-3凝膠濃度和DNA分子有效分離范圍實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第9頁上樣注意事項加樣時槍頭不要碰壞凝膠控壁，不然DNA帶型不整齊，加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中溶液以趕走樣品空中氣泡；每孔最大上樣量取決于DNA樣品片段大小，數(shù)目及樣品孔形狀與容量；每孔最大上樣容積決定于樣品孔體積；DNAmarker可在兩側(cè)樣品孔均加上．實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第10頁電泳注意事項電源接通前應(yīng)該核實(shí)凝膠方向是否放置正確；電泳儀有電壓不一定標(biāo)志電泳槽已經(jīng)接通，應(yīng)該觀察正負(fù)極鉑金絲是否有氣泡出現(xiàn)，如負(fù)極氣泡（H2)比正極(O2)多一倍，表示電泳槽已接通電源，幾分鐘后可見指示劑溴酚藍(lán)向正極移動；電泳過程中，EtBr向負(fù)極移動，與DNA泳動方向相反，較長時間電泳會造成靠正極方向凝膠中EB含量降低，對于含量較少DNAfragment檢測困難，可重新染色．凝膠中加入EB進(jìn)行電泳，便于隨時紫外線下觀察電泳狀態(tài)，但EB會造成線性DNA遷移率下降１５％．實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的方法第11頁1、凝膠制備：稱取1gagarose,加100ml0.5TAEorTBE，微波爐或電爐溶解。2、制膠：待熔化agarose溫度降到60℃以下后，將agarose倒進(jìn)插了梳子膠盒中。30-40min后，膠完全凝固，取梳子，將膠放入電泳槽中，緩沖液沒過膠約0.5–1cm。3、制樣：依據(jù)上樣緩沖液濃度加樣，如6*loadingbuffer,則1ulloadingbuffer+5ulDNAsample,類推。4、點(diǎn)樣：用移液器將DNA加到樣品孔中。注意加DNAMarker。5、接通電源，紅為正極，黑為負(fù)極，DNA往正極移動，1-5V/cm，6、依據(jù)指示劑移動位置決定終止電泳。將電壓調(diào)到零，關(guān)機(jī)，再取出凝膠，EB染色10-20分鐘，紫外燈下觀察，攝影。實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳一原理二目的掌握核酸電泳的