基因工程原理第七章

基因工程原理第七章第1頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一動(dòng)物細(xì)胞基因操作動(dòng)物細(xì)胞基因操作的必須性:可進(jìn)行細(xì)菌和真菌細(xì)胞所無(wú)法進(jìn)行的真正的翻譯后修飾載體1)非復(fù)制質(zhì)粒載體2)帶有病毒復(fù)制子的質(zhì)粒3)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體細(xì)胞：與細(xì)胞本身特性、載體、轉(zhuǎn)移、應(yīng)用相關(guān)轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移技術(shù)、瞬時(shí)與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染應(yīng)用：細(xì)胞研究、蛋白表達(dá)、體內(nèi)基因治療、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物第2頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)動(dòng)物細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)第3頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的途徑=轉(zhuǎn)基因技術(shù)直接DNA轉(zhuǎn)移：外源DNA通過(guò)物理轉(zhuǎn)化直接進(jìn)入細(xì)胞如顯微注射、含DNA顆粒轟擊、轉(zhuǎn)染：化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)、脂質(zhì)體、電穿孔轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過(guò)動(dòng)物病毒包裹，利用病毒可以自然感染細(xì)胞并將自身核酸分子轉(zhuǎn)入細(xì)胞的能力。第4頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)染技術(shù)化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)(利用胞吞作用)1)DNA/磷酸鈣共沉淀法適用于單層生長(zhǎng)細(xì)胞，不適用于懸浮或成團(tuán)生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)某些細(xì)胞有毒性，難以轉(zhuǎn)染2)二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)

可溶性聚陽(yáng)離子制劑，不能用于形成穩(wěn)定的細(xì)胞系脂質(zhì)體(利用胞吞作用)

低毒性，易操作，效率高，適用細(xì)胞類(lèi)型多，甚至可轉(zhuǎn)染活體細(xì)胞電穿孔(利用電脈沖在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)的納米大小的孔）第5頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)移后DNA的命運(yùn)具備在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的復(fù)制起始子，可以穩(wěn)定復(fù)制(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)可以整合到基因組DNA上，穩(wěn)定復(fù)制(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)不具備在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，也沒(méi)有整合到基因組DNA上，瞬時(shí)保留(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染）DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的效率遠(yuǎn)高于DNA整合的效率兩個(gè)物理上不相連的基因可以發(fā)生共轉(zhuǎn)染，甚至可以都整合到基因組DNA上第6頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)

動(dòng)物細(xì)胞載體第7頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一動(dòng)物細(xì)胞載體非復(fù)制型載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的載體(啟動(dòng)子功能分析的載體)

選擇標(biāo)記DNA帶有病毒復(fù)制子的質(zhì)粒

SV40、BPV、EBV病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體腺病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、Lentivirus等第8頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的非復(fù)制型載體載體無(wú)法復(fù)制，也不整合于基因組上在宿主細(xì)胞中往往只能保持1-2d的穩(wěn)定可以進(jìn)行基因的表達(dá)載體上往往具有報(bào)告基因，能夠報(bào)告表達(dá)的發(fā)生第9頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一啟動(dòng)子功能分析與報(bào)告基因第10頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一選擇標(biāo)記基因未經(jīng)克隆的含TK基因的外源DNA使一些攝入細(xì)胞具有了在選擇培養(yǎng)基上生存的能力，這樣的基因稱為選擇性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)TK胸苷激酶第11頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一核苷酸從頭合成和補(bǔ)救途徑：編碼補(bǔ)救途徑的酶的基因(Hprt,Tk)可以用作選擇標(biāo)記第12頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一共轉(zhuǎn)化與選擇標(biāo)記兩個(gè)物理上不相連的基因通過(guò)共轉(zhuǎn)染，共同整合到基因組中的現(xiàn)象這是由于發(fā)生了整合之前的DNA融合只要能同時(shí)轉(zhuǎn)入一個(gè)選擇標(biāo)記基因，共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象就可以使任何外源DNA序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞根據(jù)標(biāo)記基因篩選方法，選擇標(biāo)記可以分為：內(nèi)源性選擇標(biāo)記、顯性選擇標(biāo)記、擴(kuò)增選擇標(biāo)記第13頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一內(nèi)源性選擇標(biāo)記來(lái)自于動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記基因，大多數(shù)涉及與冗余內(nèi)源核苷酸生物合成途徑內(nèi)源性選擇標(biāo)記的缺點(diǎn)：只能用于那些對(duì)應(yīng)基因不具有功能的突變細(xì)胞。第14頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一顯性選擇標(biāo)記顯性選擇標(biāo)記：往往來(lái)自于細(xì)菌(外源)，因此其所提供的表型對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是全新的，可用于任何細(xì)胞。這些標(biāo)記通常是細(xì)菌的抗藥基因，因此陽(yáng)性細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)乃幬餄舛鹊呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行篩選。第15頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一擴(kuò)增選擇標(biāo)記當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞暴露在某種藥物的有毒濃度中，少數(shù)個(gè)別細(xì)胞由于自發(fā)的、擴(kuò)增性的抗藥突變而存活，這樣的DNA上的擴(kuò)增性標(biāo)記，稱為擴(kuò)增選擇標(biāo)記出現(xiàn)擴(kuò)增選擇性標(biāo)記的細(xì)胞栽種群中是隨機(jī)出現(xiàn)的，可進(jìn)行高濃度抗藥性的篩選側(cè)翼DNA序列可隨標(biāo)記基因一起擴(kuò)增氨基蝶呤DHFR葉酸第16頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一擴(kuò)增選擇標(biāo)記擴(kuò)增選擇標(biāo)記也?？捎糜趦?nèi)源或顯性選擇標(biāo)記，但常常用于擴(kuò)增選擇的藥物不同第17頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一擴(kuò)增選擇標(biāo)記常用于外源基因的高效表達(dá)第18頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一復(fù)制子載體：帶有病毒復(fù)制子的載體病毒基因組具有在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制的能力可能造成溶解性感染，使宿主細(xì)胞裂解，如SV40，由于宿主細(xì)胞的裂解，實(shí)現(xiàn)的是一種高水平瞬時(shí)表達(dá)可能造成潛伏性感染，從而并不影響宿主細(xì)胞生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，如EBV和PBV，其中EBV載體相對(duì)于PBV載體復(fù)制更加穩(wěn)定第19頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一SV40（猴多瘤病毒DNA）第20頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體外源DNA分子包入病毒粒子(通過(guò)連接或同源重組的方式插入病毒載體），后者吸附到細(xì)胞表面從而進(jìn)入細(xì)胞效率很高，而且具有高效復(fù)制與高水平表達(dá)基因的潛能不僅可用于培養(yǎng)細(xì)胞，也可用于活體細(xì)胞腺病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、Lentivirus等第21頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一可復(fù)制病毒載體與復(fù)制缺陷型病毒載體當(dāng)轉(zhuǎn)移基因插入到基因組中或它所替換的基因?qū)τ谠谒拗骷?xì)胞中的感染周期不是必需時(shí)，載體可以獨(dú)立的增殖，稱為可復(fù)制的或不依賴輔助病毒載體。當(dāng)轉(zhuǎn)入基因替換了病毒的必需基因時(shí)，這樣的載體則稱為復(fù)制缺陷型或輔助病毒依賴性載體。因?yàn)樗鼈兪サ墓δ苄枰ㄟ^(guò)共轉(zhuǎn)入攜帶有載體所缺失基因的輔助病毒來(lái)提供。第22頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一可復(fù)制病毒載體與復(fù)制缺陷型病毒載體:以桿狀病毒為例第23頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一無(wú)內(nèi)含載體不具有所有病毒編碼序列的載體，只含有包裝和基因組擴(kuò)增所必需的順式作用元件。優(yōu)點(diǎn):1)可容納高容量的外源DNA2)不產(chǎn)生病毒基因產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性第24頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)細(xì)胞與應(yīng)用第25頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一正常動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性第26頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一宿主動(dòng)物細(xì)胞所需特性第27頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一正常細(xì)胞生長(zhǎng)特性和宿主細(xì)胞所需特性上的差異某種程度上造成了各種表達(dá)系統(tǒng)對(duì)宿主細(xì)胞選擇和應(yīng)用的差異第28頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第四節(jié)

動(dòng)物基因操作第29頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一動(dòng)物基因工程動(dòng)物基因工程動(dòng)物基因工程動(dòng)物細(xì)胞基因工程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體動(dòng)物工程細(xì)胞動(dòng)物遺傳性狀改良藥物篩選研究評(píng)價(jià)模型人體基因治療蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研究評(píng)價(jià)模型第30頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一動(dòng)物基因工程哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞同源重組基因?qū)ぐ锌寺⊙蚝艘浦财渌棺祫?dòng)物爪蟾無(wú)脊椎動(dòng)物

果蠅第31頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法體細(xì)胞-卵細(xì)胞核替換顯微注射受精卵反病毒侵染胚胎干細(xì)胞或早期胚第32頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)基因小鼠大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞在發(fā)育能力上受到限制，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：分化的細(xì)胞無(wú)法完全去分化和重復(fù)發(fā)育動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)生殖細(xì)胞系轉(zhuǎn)化的唯一途徑就是在形成生殖細(xì)胞系的發(fā)育階段之前把DNA導(dǎo)入全能細(xì)胞胚胎干細(xì)胞(EsCells)是這樣一個(gè)動(dòng)物體特殊的全能細(xì)胞第33頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)基因小鼠中的DNA轉(zhuǎn)移方法直接顯微注射：注入剛受精卵細(xì)胞的雄或雌性原核中重組反轉(zhuǎn)錄病毒：不適宜產(chǎn)生完全的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可用于形成胚轉(zhuǎn)基因部分Es細(xì)胞轉(zhuǎn)染：可利用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記進(jìn)行篩選

第34頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一胚胎干細(xì)胞(EsCells)取自生殖細(xì)胞發(fā)育前的早期胚具有發(fā)育成動(dòng)物的所有組織的能力受同源重組影響顯著，可以用于基因?qū)ぐ?，即可用外源DNA的同源片段精確地替換內(nèi)源基因組的片段。第35頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Es細(xì)胞的基因?qū)ぐ型庠碊NA的同源片段精確替換內(nèi)源基因組片段的過(guò)程由于同源重組的幾率遠(yuǎn)低于隨機(jī)整合，進(jìn)行尋靶的細(xì)胞需要有較高的同源重組能力體外操作的多能性、可操作性以及同源重組的能力使Es細(xì)胞成為唯一適合于產(chǎn)生定向突變小鼠的細(xì)胞，即在每個(gè)細(xì)胞中攜帶有相同突變并能將其傳遞給生殖細(xì)胞系的小鼠。標(biāo)記基因已被運(yùn)用到尋靶過(guò)程和其后的篩選

第36頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一尋靶載體特化的質(zhì)粒載體，導(dǎo)入到Es細(xì)胞后可以促進(jìn)同源重組促進(jìn)同源重組的原因主要是含有一段同源區(qū)轉(zhuǎn)染前載體的線性化，有助于重組效率的提高多數(shù)基因?qū)ぐ惺菫榱舜驍鄡?nèi)源基因位點(diǎn)，使之無(wú)效，稱為基因敲除第37頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一兩種類(lèi)型的尋靶載體：替代與插入