宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用

宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第1頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一1.宏基因組概述2.環(huán)境宏基因組學(xué)基本技術(shù)3.環(huán)境宏基因組學(xué)技術(shù)的主要瓶頸第2頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一1.宏基因組概述

1.1.微生物資源開發(fā)應(yīng)用的新途徑據(jù)估計每克土壤樣品中可含有高達4,000種的不同微生物，1g土壤就包含6.1×107個基因。傳統(tǒng)途徑—培養(yǎng)途徑開發(fā)環(huán)境微生物基因資源較為傳統(tǒng)的研究途徑是:分離微生物,獲得純培養(yǎng),基因表達產(chǎn)物活性檢測、活性物質(zhì)的分離純化直至開發(fā)利用。這一途徑被證明是十分有效的,也獲得了諸多有應(yīng)用價值的活性物質(zhì)。但是,環(huán)境中僅有0.1%~1%的微生物能夠采用現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)進行分離培養(yǎng),在今天采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法已很難發(fā)現(xiàn)新的活性物質(zhì),極大地限制了未培養(yǎng)微生物基因資源的開發(fā)利用。第3頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一新途徑—宏基因組途徑近年來發(fā)展起來的宏基因組克隆技術(shù),直接提取環(huán)境樣品核酸進行遺傳操作,避開了微生物分離培養(yǎng)問題,極大地擴展了微生物資源的利用空間。已在土壤生態(tài)環(huán)境、海洋生態(tài)環(huán)境和各種極端環(huán)境中開展應(yīng)用。第4頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一第5頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一1.2.宏基因組定義“1998年Handelsman等首次提出宏基因組的概念。一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象,以功能基因篩選和測序分析為研究手段,以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系、及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。第6頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一宏基因組文庫既包括了可培養(yǎng)的,又包括了未培養(yǎng)的微生物遺傳信息,因此增加了獲得新生物活性物質(zhì)的機會。采用構(gòu)建宏基因組文庫的策略篩選新的基因資源及其表達活性產(chǎn)物的一般流程可以歸納為:樣品和基因(組)的富集;提取特定環(huán)境中的基因組DNA或mRNA;構(gòu)建宏基因組DNA或cDNA文庫;篩選目的基因;目的基因活性產(chǎn)物表達。第7頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一

圖2第8頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一第9頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一2.環(huán)境宏基因組學(xué)基本技術(shù)環(huán)境宏基因組學(xué)研究的基本思路是直接提取環(huán)境中所有微生物的基因組DNA,克隆到合適的載體,通過構(gòu)建宏基因組文庫,將環(huán)境中全部微生物的核酸信息收集在一起,運用序列篩選或功能篩選方式從文庫中獲得有用的酶、抗生素等生物活性物質(zhì)及相關(guān)基因。其前端關(guān)鍵性技術(shù)是環(huán)境DNA(environmentalDNA,eDNA)的提取,eDNA提取方法的精確程度將直接決定文庫中微生物信息的精確度;下游關(guān)鍵性技術(shù)是文庫的分析與篩選技術(shù)。第10頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一2.1環(huán)境樣品及目的基因組富集在宏基因組文庫篩選過程中目的基因僅占總DNA的一小部分,對環(huán)境樣品的預(yù)富集可以大大提高目的基因的檢出幾率。目前預(yù)富集技術(shù)主要分為細胞水平富集和基因組水平富集。第11頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一細胞水平富集主要是通過利用選擇培養(yǎng)基對目的微生物進行富集培養(yǎng),最常用的方法是底物選擇,此外還包括營養(yǎng)選擇及物理化學(xué)指標選擇。但是由于富集培養(yǎng)選擇性地富集了具有快速生長特性的菌群,因此導(dǎo)致大部分物種多樣性信息丟失。目前可以通過先在嚴格脅迫條件下短期處理,然后改為較溫和的處理條件,可以從一定程度上克服這種方法的局限性。第12頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一基因組水平富集常用的技術(shù)為穩(wěn)定同位素探針技術(shù)(SIP),原理是采用穩(wěn)定同位素標記底物,其中的“重”原子摻入到具有代謝活性的微生物核酸中,采用密度梯度離心的方法將“重”的DNA與“輕”組分分離,被標記的“重”核酸可以作為PCR的模板,用來構(gòu)建宏基因組文庫。此外,還有報道利用抑制性消減雜交技術(shù)、差異顯示技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、親和捕獲技術(shù)及DNA微陣技術(shù)等技術(shù)來富集目的基因。第13頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一2.2.環(huán)境宏基因組文庫篩選技術(shù)環(huán)境宏基因組文庫的篩選策略主要分為序列篩選和功能篩選2種。序列篩選策略是先從文庫中獲得目的基因,繼而對之異源表達,得到具有生物活性的產(chǎn)物;功能篩選策略則是先獲得具有生物活性的陽性克隆子,再通過插入片段測序,得到相應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)。2種分析策略對于充分利用宏基因文庫資源都是必要的。第14頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一2.3宏基因組DNA的提取獲得高濃度、大片段、無偏好的環(huán)境樣品總DNA是宏基因組文庫構(gòu)建的難點之一。第15頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一近年已有多種宏基因組DNA的提取純化方法陸續(xù)建立起來,大體可分為兩類:一類是直接提取法,又稱原位提取法。這類方法不經(jīng)過樣品中微生物的培養(yǎng)和分離,通過化學(xué)法、酶解法或物理法直接破碎環(huán)境中的微生物細胞而使DNA得以釋放,并對DNA進行純化。該法操作簡便、省時、成本低,所獲得DNA具有較好的完整性,并能夠代表某一生境的微生物群落多樣性。但常會出現(xiàn)細胞裂解不完全或DNA與土壤雜質(zhì)成分產(chǎn)生共沉淀而無法有效地去除等問題,所以一般需要進一步的DNA純化處理,同時所提取獲得的DNA片段較小(1kb~50kb),主要適用于小片段文庫的構(gòu)建。第16頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一另一類是間接提取法,即異位提取法,是利用離心介質(zhì)或者梯度離心等方法先把微生物從環(huán)境樣品中分離出來,再按處理純培養(yǎng)細胞的方法裂解微生物細胞提取DNA。該法獲得的宏基因組DNA受到胞外雜質(zhì)污染干擾較少,純度較高、DNA完整性好(20kb~500kb),適合構(gòu)建大片段的宏基因組文庫。但該法操作較繁瑣、費時、成本高、偏差大、DNA得率較低,其產(chǎn)率只是直接裂解法的1%~10%,且獲得的DNA往往不能完全代表樣品所在生境的生態(tài)學(xué)多樣性。第17頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一2.4宏基因組文庫的構(gòu)建

載體的選擇載體選擇在宏基因組技術(shù)中占有十分重要的地位。載體系統(tǒng)的選擇主要依賴于DNA提取質(zhì)量、插入片段、質(zhì)?？截悢?shù)、宿主菌及篩選方法。根據(jù)克隆載體的不同宏基因組文庫可分為質(zhì)粒文庫、細菌/酵母人工染色體文庫、噬菌體類載體文庫。第18頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一早期宏基因組文庫主要以質(zhì)粒載體和大腸桿菌宿主細胞構(gòu)建而成的小片段(<15kb)文庫。該文庫操作簡便、拷貝數(shù)高、對DNA質(zhì)量要求不高,適合純度低或剪切較嚴重的DNA模版。但插入片段小,篩選量大,活性比率低,對大基因簇無能為力,主要適用于分析新的基因序列信息及篩選編碼代謝相關(guān)的單一基因或小操縱子。然而,很多微生物活性物質(zhì)是其次生代謝產(chǎn)物,代謝途徑由多基因簇調(diào)控,因此盡量插入大片段DNA以獲得完整的代謝途徑多基因簇是很有必要的。第19頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一目前多采用細菌人工染色體(BAC)和粘粒(Cosmid)載體,前者插入片段大(可達350kb),但克隆效率低,后者插入片段中等(20~40kb),克隆效率高。BAC和Cosmid載體在宿主細胞中的穩(wěn)定性高,但拷貝數(shù)低,宏基因的擴增困難,表達量低。Fosmid載體的插入片段與Cosmid相當,但Fosmid插入片段在E.coli中的克隆效率和穩(wěn)定性更高。外源基因的表達受宿主細胞的遺傳類型、細胞基質(zhì)、細胞的生理狀態(tài)及初級代謝產(chǎn)物等的影響,利用穿梭載體擴大宿主范圍有利于促使和提高外源基因的表達。為提高和調(diào)控外源基因的拷貝數(shù)與表達量,常需構(gòu)建不同類型的載體。第20頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一此外,λ-噬菌體和其他病毒也可以作為構(gòu)建宏基因組克隆文庫的載體。噬菌體展示庫是一種十分有效的高通量篩選技術(shù),該技術(shù)通過對表面展示表達產(chǎn)物的親和選擇分離相應(yīng)的DNA序列,能夠從宏基因組中富集稀有DNA序列,但其局限性在于只能表達分子量小于50kD的蛋白。第21頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一宿主細胞的選擇宿主菌株的選擇主要考慮轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主細胞中的穩(wěn)定性、宏基因的表達、目標性狀(如抗菌)缺陷型等因素。研究經(jīng)驗表明不同微生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型有明顯差異,不同的研究目標應(yīng)選擇不同的宿主菌株,如70%的抗生素來源于放線菌,如以尋找抗菌抗腫瘤活性物質(zhì)為目標,選擇鏈霉菌為宿主較理想,而篩選新的酶則采用大腸桿菌為宜。第22頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一其中E.coli是最常用的宿主細胞,其優(yōu)點是操作簡單、繁殖迅速、培養(yǎng)代謝易于控制。但是由于環(huán)境樣品的總DNA有很大一部分為真核基因組DNA,其在細菌宿主中往往不能表達,大大限制了這部分基因的篩選。最近的生物信息學(xué)研究表明,對于一個插入子(<10kb)的文庫,為尋找一個目的基因需要篩選105~106個克隆,這表明從復(fù)雜的宏基因組中篩選目的基因在技術(shù)上還存在著其特殊的困難。因此,宿主系統(tǒng)的進一步探索是更有效的開發(fā)宏基因組資源的關(guān)鍵技術(shù)之一。第23頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一2.5宏基因組文庫篩選由于宏基因組文庫容量較大,目標克隆子的篩選一直是宏基因組學(xué)技術(shù)中的瓶頸。近年來,各種宏基因組文庫篩選方法相繼建立起來,根據(jù)篩選原理大體分為兩大類:序列依賴性篩選法和非序列依賴性篩選法。第24頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一序列依賴性篩選法序列依賴性篩選法是根據(jù)文庫中的已知序列或保守序列來設(shè)計雜交探針或PCR引物,從宏基因組文庫中篩選目標序列。該法克服了功能篩選法中必須依賴表達后的活性產(chǎn)物進行檢測,效率較高。其中已知功能基因PCR擴增技術(shù)是最為常用的序列依賴性篩選法。此外,DNA微陣技術(shù)和整合子系統(tǒng)技術(shù)也可以作為序列依賴性篩選法。第25頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一但是已知功能基因PCR擴增技術(shù)篩選法存在2個主要的缺陷:(1)引物的設(shè)計依賴于已有的序列信息,共同進化的2個功能相似的基因難于用“族特異性”引物區(qū)分開來,因此很難發(fā)現(xiàn)新的功能基因。(2)通過PCR擴增功能基因,一般只能獲得結(jié)構(gòu)基因的一個片段,而不能獲得完整的功能基因。第26頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一非序列依賴性篩選法非序列依賴性篩選法,其不依賴于任何已知序列信息,僅根據(jù)文庫克隆子產(chǎn)生的活性物質(zhì)進行篩選。其中以功能篩選法最為常用,原理是直接對目的克隆表達的性狀在選擇培養(yǎng)基上進行篩選。該法篩選能夠發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)或全長基因,但工作量大、效率低,生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物僅在少數(shù)情況下具有可見性狀,酶活性的檢測受到研究方法的限制。此外,由于受到酶活檢測方法的限制,大多數(shù)寶貴的酶資源不能通過上述基于活性的方法發(fā)掘出來。第27頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一近期基因陷阱技術(shù)篩選法倍受研究學(xué)者們的關(guān)注,(1)利用目的基因缺失的突變體宿主菌株,轉(zhuǎn)化后在選擇性培養(yǎng)基上進行功能互補的生長特征來篩選。(2)將宏基因組DNA隨機克隆到無啟動子的綠色熒光蛋白基因(GFP)前面,然后通過熒光激活細胞分離(FACS)技術(shù),在添加特定底物的條件下對表達庫進行富集,就能夠選擇出對該底物具有代謝活性的克隆。第28頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一該法優(yōu)點在于它為高通量篩選提供了保障,而且不需要對底物進行修飾,尤其適合于工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。但也存在一些問題:(1)無法利用不能進入細胞質(zhì)的底物;(2)熒光激活細胞分離儀(FACS)對進樣設(shè)備的要求也比較高;(3)建立高度耐受“超相容性”表達系統(tǒng),以表達任意來源的編碼蛋白和酶具有一定難度。第29頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一3.環(huán)境宏基因組學(xué)技術(shù)的主要瓶頸

3.1.環(huán)境宏基因組文庫前端技術(shù)的主要瓶頸

eDNA提取技術(shù)尚存在若干瓶頸.①從DNA片段大小分析,高分子量eDNA的獲得是從文庫中捕捉編碼藥物等物質(zhì)完整基因簇的先決條件.土壤環(huán)境中,由于微生物與土壤顆粒緊密結(jié)合的特性以及腐殖酸等抑制性物質(zhì)存在等原因,從中難以獲得適于構(gòu)建宏基因組文庫的高分子量eDNA。第30頁，共34頁，2023年，2月20日，星期一至今基于原位裂解獲得>