植物功能基因組研究技術(shù)進(jìn)展課件

植物功能基因組研究引言結(jié)構(gòu)基因組學(xué)代表基因組分析的早期階段，以建立生物體高分辨率遺傳、物理和轉(zhuǎn)錄圖譜為主功能基因組學(xué)代表基因分析的新階段，是利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息系統(tǒng)地研究基因功能，它以高通量、大規(guī)模實(shí)驗(yàn)方法以及統(tǒng)計(jì)與計(jì)算機(jī)分析為特征基因的功能

生物學(xué)功能，如作為蛋白質(zhì)激酶對(duì)特異蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化修飾；細(xì)胞學(xué)功能，如參與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞途徑；發(fā)育上功能，如參與形態(tài)建成等。

突變體是研究基因功能的傳統(tǒng)方法

promotorexoninonT-DNA插入突變機(jī)理terminator獲得突變體的方法物理因素；指某些射線，如Y射線、X射線、B射線和中子流等；化學(xué)誘變劑:指某些烷化劑，堿基類(lèi)似物，抗生素等化學(xué)藥物。由重組DNA技術(shù)衍生出的插入突變:它是人為地造成某一待研究基因的突變體，并根據(jù)由此帶來(lái)的表型特征的改變來(lái)分析該基因的功能，然后再進(jìn)行基因等分子水平上的研究，水稻突變體多柱頭巨胚米雙胚苗水稻突變體庫(kù)研究進(jìn)展1998年，國(guó)際水稻遺傳協(xié)會(huì)報(bào)告了571個(gè)定位的突變體基因2005年6月，Gramene網(wǎng)站報(bào)道了1488個(gè)水稻突變體，Oryzabase網(wǎng)站公布了約1698個(gè)水稻突變體和基因(含數(shù)量性狀基因)，突變體的缺陷這主要表現(xiàn)在突變必須被測(cè)序或者做圖以證明他們的位置，并且突變材料的大規(guī)模收集必須要通過(guò)對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行篩選。這些限制也就意味著基因組規(guī)模上的突變：技術(shù)含量底，工作量過(guò)大。而且突變具有很大的隨機(jī)性，經(jīng)常給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)不便，反義RNA反義RNA作用機(jī)理B、光合作用的Lhca4基因功能的研究Lhca1和Lhca4編碼LHCⅠ蛋白,該蛋白是光合系統(tǒng)ⅠPSⅠ的葉綠素a

Pb結(jié)合蛋白。通過(guò)反義技術(shù),

Zhang等研究Lhca4的功能。實(shí)驗(yàn)表明,在轉(zhuǎn)基因株系中,Lhca4蛋白的減少并未引起Lhca1蛋白的降低,由于Lhca4蛋白的減少,低溫?zé)晒獍l(fā)射光譜明顯地改變了,而且發(fā)射最大值向藍(lán)光偏移了6nm,說(shuō)明與Lhca4相關(guān)的葉綠素分子與長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光發(fā)射光譜有關(guān)。C、番茄的pTOM5基因功能鑒定

利用反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)部分抑制可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因株系。pTOM5基因是番茄果實(shí)成熟過(guò)程中類(lèi)胡蘿卜素的合成基因。pTOM5反義基因轉(zhuǎn)入番茄中,果實(shí)呈黃色,花呈淡黃色,類(lèi)胡蘿卜素合成受阻,含量減少了97%。由此推測(cè)pTOM5是控制果實(shí)成熟及類(lèi)胡蘿卜素合成的一個(gè)基因。RNAiRNAi作用機(jī)理由于擬南芥是目前植物基因組資源研究最深入的植物種類(lèi),所以RNAi技術(shù)在植物功能基因組中的研究主要體現(xiàn)在擬南芥功能基因組的研究上,

CATMA

(CompleteArabidopsistranscrip2tiomemicroarray)計(jì)劃以及AGRIKOLA

(ArabidopsisgenomicRNAiknock-outlineanalysis)都在應(yīng)用RNAi進(jìn)行大規(guī)模的擬南芥功能基因組的分析。除此之外,RNAi技術(shù)在其它植物功能基因分析中也得到嘗試.例如Kenichi等(2004)應(yīng)用RNAi技術(shù)分析并證實(shí)phEIN2基因在牽?；ㄖ幸蚁┬盘?hào)傳導(dǎo)中具有重要作用,Senthil等(2005)用RNAi技術(shù)分析了異黃酮合成酶基因在大豆子葉及根部的作用效果及其對(duì)異黃銅積累的影響,證實(shí)大豆子葉對(duì)基于RNAi的基因功能分析有效。李小平等（2006）根據(jù)植物中hpRNA(hairpinRNA)的原理，以大豆類(lèi)受體蛋白激酶基因rlpk2為靶基因，成功敲減((knock-down)rlpk2基因，并且發(fā)現(xiàn)敲減大豆葉片中的rlpk2基因表達(dá)明顯改善大豆葉片的光合能力。Godfrey等（2005）用RNAi的方法研究了MPK6基因使植物對(duì)臭氧比對(duì)照敏感，而MPK3對(duì)臭氧也有相似的反應(yīng)，從而推斷這兩個(gè)MAPKs在對(duì)臭氧的調(diào)節(jié)方面的機(jī)理是相似的?；虮磉_(dá)的系統(tǒng)分析(原理)從轉(zhuǎn)錄本的3′端特定位置分離出的該轉(zhuǎn)錄本特異的標(biāo)簽(tag)包含有足夠的能代表該轉(zhuǎn)錄本所需之信息,依SAGE方法之不同,這一標(biāo)簽的長(zhǎng)度通常在9～14個(gè)核苷酸之間變化。將多個(gè)短序列標(biāo)簽串連在一個(gè)克隆中，通過(guò)測(cè)序以連續(xù)的方式同時(shí)分析多個(gè)標(biāo)簽及其代表的轉(zhuǎn)錄子，明顯提高了分析效率。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，計(jì)算某一標(biāo)簽出現(xiàn)的次數(shù)來(lái)確定相應(yīng)轉(zhuǎn)錄子的拷貝數(shù)與表達(dá)水平。用p1和p2為引物PCR再次用錨定酶酶切基因表達(dá)的系統(tǒng)分析(步驟)用PAGE膠分離把30-50個(gè)這樣的標(biāo)簽連接起來(lái)克隆到pZE1O-1

測(cè)序錨定酶的性質(zhì)NlaIII是一種非常廣泛的限制性內(nèi)切酶,平均每250bp就有一個(gè)NlaIII的識(shí)別位點(diǎn),此酶可識(shí)別CATG四核苷酸的回文序列,因此經(jīng)此酶切割后所得之cDNA的3′端含有一個(gè)懸垂在外的GTAC四核苷酸GTACCATGCATGGGGACCATGGGGACAp1Bp2接口A、B的結(jié)構(gòu)及其連接與酶切生物素生物素SAGE技術(shù)在鑒定植物基因功能中的應(yīng)用水稻和酵母等模式生物的研究中發(fā)揮了重要的作用。此外,Matsumura等(1999)還從水稻秧苗中分離出10122個(gè)標(biāo)簽并發(fā)現(xiàn)其中的23.1%可與1367個(gè)水稻的cDNA、EST匹配。其中許多高表達(dá)的基因均屬編碼核糖體蛋白、或與新陳代謝和細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)的管家基因。孫亮先（2006）對(duì)水稻幼苗SAGE文庫(kù)的構(gòu)建也進(jìn)行了探索試驗(yàn)?；蛐酒脑韺ふ倚禄?并推測(cè)一些已知基因的功能SekiMetal利用各種發(fā)育時(shí)期,經(jīng)不同處理(干旱、冷害及未經(jīng)脅迫處理)的擬南芥構(gòu)建cDNA文庫(kù),從中得到了1300個(gè)全長(zhǎng)的cDNA,并制作成cDNA芯片,與特異探針進(jìn)行雜交,結(jié)果1300種cDNA中有44種是受干早誘導(dǎo),19種受冷害誘導(dǎo),其中30種和10種是從未報(bào)道過(guò)的脅迫誘導(dǎo)基因,并且12種脅迫誘導(dǎo)基因被鑒定為受DREB1調(diào)控的靶基因,其中6個(gè)是未報(bào)道過(guò)的新基因(MotoakiS,etal,2001)。ArumugamKathiresan,H.R等（2006）用基因芯片技術(shù)研究了水稻在干旱脅迫的條件下，mRNA的表達(dá)情況。由于其干旱時(shí)有一個(gè)或多個(gè)基因變化，因此用基因芯片技術(shù)有較大的優(yōu)勢(shì)。問(wèn)題與展望物理、化學(xué)誘變、基因沉默以及插入突變等方法都可以用