分子生物學常用檢測技術詳解演示文稿

分子生物學常用檢測技術詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)二十五頁\編于三點優(yōu)選分子生物學常用檢測技術目前二頁\總數(shù)二十五頁\編于三點DNA—四種核苷酸（A-T-C-G)組成的多聚骨架所有組成DNA的核苷酸dATP,dTTP,dCTP,dGTP都由三種成分組成：1）一個2’-脫氧核糖（戊糖）2）一個含氮堿基嘌呤：A\G嘧啶：T/C3）三個磷酸基團各單個核苷酸由5’和3’-碳形成的磷酸二酯鍵連接在一起目前三頁\總數(shù)二十五頁\編于三點變性、復性、退火和淬火目前四頁\總數(shù)二十五頁\編于三點基因目前五頁\總數(shù)二十五頁\編于三點分子生物學常用技術

PCR（聚合酶鏈式反應）核酸分子雜交基因芯片技術(biochip)DNA測序（DNAsequencing）DNA重組技術(DNArecombination)目前六頁\總數(shù)二十五頁\編于三點

一、聚合酶鏈反應

（PolymeraseChainReaction，PCR）體外基因擴增技術

特異性強靈敏度高操作簡單、省時對待檢原始材料質量要求低高效率的基因擴增技術目前七頁\總數(shù)二十五頁\編于三點（一）PCR原理原理雙鏈DNA變性

退火鏈延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復目前八頁\總數(shù)二十五頁\編于三點PCR反應體系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq

DNA聚合酶模板引物

和或和（二）PCR反應的設計及影響因素目前九頁\總數(shù)二十五頁\編于三點PCR的種類熒光定量PCR通用引物PCR多重PCR巢式PCRRT-PCR原位PCR免疫PCR……目前十頁\總數(shù)二十五頁\編于三點TaqMan探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'熒光定量PCR目前十一頁\總數(shù)二十五頁\編于三點定量PCR的數(shù)學原理PCR理論方程N=N0x(1+E)nN：擴增數(shù)量N0：起始模板數(shù)量E：擴增效率N：循環(huán)數(shù)

Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長期Linear平臺期Plateauy=

N0(1+e)n指數(shù)增長期Geometric目前十二頁\總數(shù)二十五頁\編于三點定量PCR的數(shù)學原理Rn(熒光強度)循環(huán)數(shù)CycleNumber指數(shù)增長期平臺期CT=-klogN0+bCt

（Cyclethreshold）值：是指每個反應管內的熒光信號到達設定域值（threshold）時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。目前十三頁\總數(shù)二十五頁\編于三點PCR的臨床應用對病原微生物核酸進行快速檢測彌補免疫檢測的缺陷縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）用于藥物療效監(jiān)測和評估用于腫瘤基因表達方面的研究用于遺傳病的診斷目前十四頁\總數(shù)二十五頁\編于三點項目標本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標本。2.也可取抗凝血標本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標本或咽拭子。也可取抗凝血標本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標本：留于無菌試管。3.也可取抗凝血標本,但一般不推薦。MP呼吸道病毒

咽拭子樣本采集要求目前十五頁\總數(shù)二十五頁\編于三點項目標本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉數(shù)圈取出分泌物（應略帶粘膜）。前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內，停5秒后旋動棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV目前十六頁\總數(shù)二十五頁\編于三點二、核酸分子雜交根據(jù)核酸變性和復性的原理，不同來源的變性單鏈核酸分子在合適的條件下，通過堿基互補形成雙鏈雜交體的過程稱為核酸分子雜交（molecularhybridization）。目前十七頁\總數(shù)二十五頁\編于三點1、遺傳病的診斷2、病原體的鑒定3、癌基因突變的檢測4、組織配型5、親子鑒定核酸分子雜交的臨床應用目前十八頁\總數(shù)二十五頁\編于三點三、基因芯片技術基質材料分，有尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等。目前十九頁\總數(shù)二十五頁\編于三點

用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列原位合成法在玻璃等硬質表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列目前二十頁\總數(shù)二十五頁\編于三點基因芯片技術的應用1、藥物篩選和新藥開發(fā)2、疾病診斷3、環(huán)境保護4、司法5、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)目前二十一頁\總數(shù)二十五頁\編于三點四、測序技術CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT（一）一代測序技術目前二十二頁\總數(shù)二十五頁\編于三點（二）二代測序技術Illumina公司的Solexa和Hiseq應該說是目前全球使用量最大的第二代測序機器，這兩個系列的技術核心原理是相同的。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。目前二十三頁\總數(shù)二十五頁\編于三點目前二十四頁\總數(shù)二十五頁\編于三點技術特點比較第一代測序技術的主要特