現(xiàn)代生物技術(shù)

現(xiàn)代生物技術(shù)第1頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六研究背景實驗材料試驗方法結(jié)論實驗?zāi)康呐c原理第2頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六阿爾茨海默病

阿爾茨海默病（AD）是一種起病隱匿的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征。65歲以前發(fā)病者，稱早老性癡呆；65歲以后發(fā)病者稱老年癡呆。文獻研究背景第3頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六每年都有數(shù)百萬人患阿爾茨海默病，預(yù)計2050年每85人就有一人患此病?？墒?，目前還沒有發(fā)現(xiàn)有效治愈或抑制阿爾茨海默病的方法。

阿爾茨海默病現(xiàn)狀阿爾茨海默病的病因淀粉樣變產(chǎn)生的不溶性纖維蛋白聚合物（β淀粉樣蛋白）在大腦中沉積形成斑塊—“老年斑”，還形成有毒的可溶性的低聚物，對神經(jīng)細(xì)胞有毒害作用。第4頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六實驗?zāi)康拈_創(chuàng)一種快速有效經(jīng)濟檢測AD的方法，以便能更好的分析病情第5頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六實驗試劑

氧化石墨烯（GO）白藜蘆醇(Res)淀粉樣β蛋白(Aβ)第6頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六實驗原理

β淀粉樣蛋白AD白藜蘆醇是一種具有熒光的天然物質(zhì)，與氧化石墨烯形成復(fù)合物之后，白藜蘆醇的熒光被淬滅。這種復(fù)合物能夠準(zhǔn)確的識別β淀粉樣蛋白的單體和多聚體，并且使白藜蘆醇的熒光回復(fù)。這樣就可以通過熒光的有無來檢測β淀粉樣蛋白。第7頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六實驗原理氧化石墨烯白藜蘆醇β-淀粉樣蛋白第8頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)氧化石墨烯(grapheneoxide)是石墨烯的氧化物，是單一的原子層，可以隨時在橫向尺寸上擴展到數(shù)十微米。氧化石墨仍保持石墨的層狀結(jié)構(gòu)，但在每一層的石墨烯單片上引入了許多氧基功能團。結(jié)構(gòu)模型是在氧化石墨烯單片上隨機分布著羥基和環(huán)氧基，而在單片的邊緣則引入了羧基和羰基。

氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)及優(yōu)點

第9頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六良好的光學(xué)性質(zhì)：石墨烯氧化物由于原子結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)的不均一行，可以再從紫外到近紅外的區(qū)域發(fā)出熒光。用作熒光淬滅劑?？扇苄裕貉趸嶋H上具有兩親性，從石墨烯薄片邊緣到中央呈現(xiàn)親水至疏水的性質(zhì)分布。低毒便宜氧化石墨烯的優(yōu)點第10頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六白藜蘆醇是多酚類化合物，主要來源于葡萄（紅葡萄酒）、虎杖、花生、桑椹等植物。白藜蘆醇無味、白色晶體（甲醇）；難溶于水，易溶于乙醇等有機溶劑。熔點253-255℃，261℃即升華。在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光具有神經(jīng)保護功能能夠特異性結(jié)合β淀粉樣蛋白穩(wěn)定性較差---現(xiàn)配現(xiàn)用

白藜蘆醇

第11頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)是由淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)經(jīng)β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而產(chǎn)生的含有39～43個氨基酸的多肽。由細(xì)胞分泌，在細(xì)胞基質(zhì)沉淀聚積后具有很強的神經(jīng)毒性作用。Aβ的神經(jīng)毒性作用在阿爾茨海默病的病程進展中發(fā)揮著主要作用。

β淀粉樣蛋白

第12頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六沉積狀態(tài)（腦內(nèi)的老年斑）的Aβ對神經(jīng)元有毒性作用，引起與阿爾茨海默病的病理變化———神經(jīng)突退縮和神經(jīng)元變性溶解狀態(tài)的Aβ在短時間內(nèi)可促使某些神經(jīng)突生長，提高神經(jīng)元的存活率?？扇苄缘腁β也具有神經(jīng)毒性，不同種類的神經(jīng)元可能對不同形式的Aβ敏感。而可溶性Aβ與Aβ聚合物可能在AD進展的不同時期起作用，從而導(dǎo)致臨床表現(xiàn)的多樣性和進行性。β淀粉樣蛋白第13頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六檢測氧化石墨烯對白藜蘆醇的熒光淬滅效應(yīng)證明Res和GO結(jié)合其它蛋白質(zhì)、離子對檢測結(jié)果的影響檢測Res@GO對單體和多聚體Aβ40/Aβ42的識別作用腦部熒光顯像檢測限實驗步驟第14頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六檢測氧化石墨烯對白藜蘆醇的熒光淬滅與恢復(fù)

a:向白藜蘆醇(Res,20μM)中加入氧化石墨烯(GO,0?50μg/mL),熒光變化。b:向Res@GO中Aβ42(0?200μM)，熒光變化。

環(huán)境：磷酸鹽緩沖液中(0.2M,pH7.4)第15頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六紫外燈照射下（I）Res@GO幾乎沒有熒光

(II)加入Aβ42后熒光恢復(fù)（只需3min—快速！）第16頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六

證明Res和GO結(jié)合

每個物質(zhì)都有其特定的吸收峰氧化石墨烯：230nm白藜蘆醇：210nm、330nmRes@GO：250nm、300nm紫外吸收光譜Res和Go通過π鍵結(jié)合吸收峰改變第17頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六原子力顯微鏡下不同階段直觀圖第18頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六其它蛋白質(zhì)、離子對檢測結(jié)果的影響

當(dāng)Res@GO遇到Aβ42(200μM)和核糖核酸酶A、溶酶體、胃蛋白酶、細(xì)胞色素C、生理緩沖液中各種離子時的熒光變化。可以說明其它蛋白、離子對實驗結(jié)果并沒有干擾作用，Res@GO與Aβ42的結(jié)合具有特異性

。第19頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六檢測Res@GO分別對Aβ40、Aβ42的單體與多聚體的識別作用

上圖說明：Aβ40、Aβ42的單體與多聚體都可以被Res@GO特異性識別。第20頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六患AD病小鼠腦部熒光顯像

b與c疊加后重合度顯示圖上圖直觀表明本研究方法與傳統(tǒng)檢測方法檢測到物質(zhì)相同，此方法是準(zhǔn)確的第21頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六被測物的檢測限橫坐標(biāo)表示檢測物濃度，縱坐標(biāo)表示熒光吸收值a：Aβ40單體b：Aβ40多聚體c：Aβ42單體d：Aβ42多聚體由上圖可推出其檢出限分別為277、219、270、120nM第22頁，共25頁，2023年，2月20日，星期六實驗方法的優(yōu)點1.省時傳統(tǒng)的熒光免疫檢測需要12h;本方法在鼠腦中30min即可顯像，在生理