第十章核酸的生物合成詳解

第十章核酸的生物合成詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點優(yōu)選第十章核酸的生物合成目前二頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點半保留復(fù)制（semiconservativereplication）：在DNA復(fù)制時，親代DNA的雙螺旋先行解旋和分開，然后以每條鏈為模板，按照堿基配對原則，在這兩條鏈上各形成一條互補鏈。這樣，從親代DNA的分子可以精確地復(fù)制成2個子代DNA分子。每個子代DNA分子中，有一條鏈是從親代DNA來的，另一條則是新形成的。DNA的生物合成機制——半保留復(fù)制目前三頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點目前四頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點1957年Meselson及Stahl通過實驗證實了半保留復(fù)制的模式。半保留復(fù)制的實驗證據(jù)目前五頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點1963年，Cairns用放射自顯影的方式觀察到大腸桿菌正在復(fù)制中的DNA，在用氚標記的胸苷復(fù)制近兩代，放射自顯影，未復(fù)制部分銀密度低，由一條放射鏈和一條非放射鏈組成；已復(fù)制部分有一條雙鏈是放射的，一條雙鏈有一半是放射的。這證明大腸桿菌DNA是環(huán)狀分子，以半保留方式復(fù)制。半保留復(fù)制的實驗證據(jù)目前六頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點1956年，Arthur

Kornberg首先從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶（DNA聚合酶Ⅰ）。70－71年分離出Ⅱ和Ⅲ。1999年發(fā)現(xiàn)Ⅳ、Ⅴ，涉及錯誤傾向修復(fù)DNA聚合酶及其發(fā)現(xiàn)目前七頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點以四種dNTP為底物需要模板指導(dǎo)需要有引物3’-羥基存在DNA鏈的生長方向是5’→3’產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同DNA聚合酶的反應(yīng)特點目前八頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點大腸桿菌DNA聚合酶目前九頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點小片段/323aa5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段/

604aa5′→3′聚合/

5核酸外切N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ

Klenow片段目前十頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點真核生物DNA聚合酶有α、β、γ（線粒體）、δ、ε五種核DNA的復(fù)制主要由α、δ完成；α最初認為相當于聚合酶Ⅲ，現(xiàn)認為主要用于引發(fā)（因為無校正功能，僅其有引發(fā)功能）；δ能持續(xù)合成，且有校正功能。ε相當于Ⅰ，主要起修復(fù)作用，γ位于線粒體，β為修復(fù)酶。目前十一頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DNA連接酶目前十二頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DNA連接酶使雙鏈DNA切口處的5’-磷酸和3’-羥基生成磷酸二酯鍵。需供能，細菌用NAD，動物和噬菌體用ATP，形成焦磷酸鍵的活化形式，再由3’羥基發(fā)動親核攻擊，形成磷酸二酯鍵。大腸桿菌的連接酶作用于粘末端，T4的還可作用于平末端。目前十三頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DNA的合成是以四種三磷酸脫氧核糖核苷為底物的聚合反應(yīng)，該過程除了需要酶的催化之外，還需要適量的DNA為模板，RNA（或DNA）為引物和鎂離子的參與。催化這個反應(yīng)的酶也有多種，除DNA聚合酶外，還有RNA引物合成酶（即引發(fā)酶），DNA連接酶、拓撲異構(gòu)酶、解螺旋酶及單鏈結(jié)合蛋白多種蛋白質(zhì)因子參與。DNA復(fù)制有關(guān)的酶及相關(guān)蛋白因子目前十四頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DNA的復(fù)制拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶Ⅰ:切斷DNA雙鏈中一股鏈，封閉切口，反應(yīng)不需ATP。拓撲異構(gòu)酶Ⅱ:切斷DNA分子兩股鏈，利用ATP供能，連接斷端。目前十五頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DNA的復(fù)制過程——復(fù)制的起始復(fù)制的起始點：從DNA分子的特定部位開始，此特定部位稱為復(fù)制起始點（originofreplication），可以用ori表示。原核生物常只有一個起始點，E.Coli的起點為OriC，由245個bp組成（p421），非常保守。真核生物的染色體有多個復(fù)制起始點。）目前十六頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DNA甲基化與DNA復(fù)制起始密切相關(guān)DNA子鏈被合成后，起點處子鏈GATC（11個）較長時間保持未甲基化。半甲基化的oriC與細胞原生質(zhì)膜相結(jié)合。只有當oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結(jié)合，起始新一輪的DNA復(fù)制。目前十七頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ在復(fù)制起始部位將DNA引入負超螺旋。DnaA蛋白辨認、結(jié)合于起始位點，并促使解鏈。DnaB與DnaC復(fù)合物進入，生成引發(fā)前體，然后DnaB繼續(xù)發(fā)揮解鏈的作用。SSB與解開的單鏈結(jié)合，穩(wěn)定和保護單鏈。引物酶(DnaG)進入并與引發(fā)前體結(jié)合生成引發(fā)體（DnaB、DnaC蛋白、引物酶和DNA起始區(qū)）。引發(fā)體中的引物酶催化NTP聚合，生成引物。DNA拓撲異構(gòu)酶(Ⅱ型為主)在解鏈前方理順DNA鏈，松弛正超螺旋。原核生物DNA復(fù)制的起始目前十八頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3535復(fù)制的引發(fā)——形成引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。目前十九頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DNA的復(fù)制起始過程說明復(fù)制的方向：一般為雙向復(fù)制。合成的開始與甲基化有關(guān)，由甲基化酶Dnm完成起始相關(guān)蛋白，DnaA、DnaB、DnaC、DnaG等復(fù)制時需要解螺旋酶和拓撲異構(gòu)酶來解鏈的。單鏈結(jié)合蛋白(SSB)可與解開的單鏈結(jié)合，防止復(fù)性和水解復(fù)制有一些特殊方式。目前二十頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點復(fù)制叉、滯后鏈、岡崎片段與不連續(xù)復(fù)制復(fù)制叉由5’向3’方向連續(xù)復(fù)制，稱為前導(dǎo)鏈；另一條鏈復(fù)制叉由3’向5’移動，稱為滯后鏈。滯后鏈的復(fù)制中，形成許多不連續(xù)片段，稱為岡崎(Okazaki)片段。岡崎片段連接成完整的DNA引物合成酶由5’向3’方向合成RNA引物聚合酶Ⅲ在引物3’-羥基上合成DNA聚合酶Ⅰ切除引物，填補空白DNA連接酶將岡崎片段連接起來目前二十一頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點向?qū)ф湝箧湆槠?′5′3′3′5’3’目前二十二頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DNA的復(fù)制過程：半保留的半不連續(xù)復(fù)制目前二十三頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點目前二十四頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點其他DNA復(fù)制模式滾環(huán)復(fù)制D環(huán)復(fù)制（線粒體DNA)目前二十五頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)30年代，Muller等發(fā)現(xiàn)對保持染色體穩(wěn)定十分重要的染色體末端結(jié)構(gòu)—端粒。1972年JamesWatson提出復(fù)制末端問題。1984年，Blackburn發(fā)現(xiàn)草履蟲（無限增殖）具有重建端粒的酶——端粒酶。目前二十六頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點端粒端粒是真核生物線性染色體的兩個末端所具有的特殊結(jié)構(gòu),其由許多成串的短的重復(fù)序列組成。功能：維持染色體的穩(wěn)定性；保證染色體末端DNA復(fù)制的完整性TTAGGGTTAGGG…目前二十七頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點端粒酶(telomerase)端粒酶由RNA和蛋白質(zhì)組成。兼有模板和逆轉(zhuǎn)錄酶兩方面的作用多莉與細胞的死亡目前二十八頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點爬行模型動畫演示目前二十九頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點PCR——多聚酶鏈式反應(yīng)聚合鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction），K.Mullis1985年發(fā)明。是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，又稱為基因的體外擴增法。PCR技術(shù)的原理與細胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過程十分類似。1993年獲得諾貝爾獎目前三十頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點PCR主要包括三個階段變性DNA在高溫94℃變性，形成兩條單鏈。

退火反應(yīng)體系降溫至50-60℃，模板DNA與引物結(jié)合。延伸反應(yīng)體系升溫至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的指導(dǎo)下，復(fù)制出互補的DNA。目前三十一頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點一種PCR反應(yīng)體系

10×擴增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200μmol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100μl目前三十二頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點94℃，預(yù)變性5分鐘94℃，變性1分鐘55℃，退火1分鐘72

℃，延伸1分鐘最后一次72

℃，延伸5分鐘

30個循環(huán)一種PCR反應(yīng)程序設(shè)計目前三十三頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點生物因素、物化因素均可導(dǎo)致DNA的損傷1.

物理因素

紫外線、

電離輻射、αβγX-射線等2.

化學(xué)因素

烷化劑、

堿基或核苷類似物、亞硝酸鹽及亞硝胺、

代謝活化化合物（苯并笓、黃曲霉毒素等）以上物理及化學(xué)因素統(tǒng)稱誘變劑。3.

生物因素

DNA、RNA腫瘤病毒可插入基因組，引起突變。

復(fù)制時的堿基錯配，互變異構(gòu)、堿基脫氨、堿基丟失。目前三十四頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點DNA的損傷修復(fù)主要有五種修復(fù)系統(tǒng)：錯配復(fù)活（mismatchrepair)直接修復(fù)（directrepair)切除修復(fù)（excisionrepair）重組修復(fù)（recombinationrepair）易錯修復(fù)（error-pronerepair）目前三十五頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點錯配復(fù)活(MismatchRepair)原核細胞內(nèi)存在Dam甲基化酶，能使5`GATC中A的N6位甲基化。復(fù)制后DNA在短期內(nèi)（數(shù)分鐘）為半甲基化的GATC序列。細胞錯配系統(tǒng)能區(qū)別新鏈與舊鏈。MutS二聚體與其識別結(jié)合，兩向移動形成突環(huán)至GATC。核酸內(nèi)切酶（MutH）從未甲基化的GATC5’端開切，重新合成（DNA聚合酶）目前三十六頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點目前三十七頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點直接修復(fù)（DirectRepair)光復(fù)活酶可被可見光激活，分解UV照射形成的嘧啶二聚體。O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶能去除O6上的甲基，恢復(fù)正常的鳥嘌呤。

UV目前三十八頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶去除O6上的甲基目前三十九頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點切除修復(fù)（ExcisionRepair）是細胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)機制，主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。多種特異的核酸內(nèi)切酶，識別DNA損傷部位，在其附近將DNA單鏈切開，再由外切酶將損傷鏈切除，由聚合酶以完整鏈為模板進行修復(fù)合成，最后有連接酶封口。目前四十頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點目前四十一頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點重組修復(fù)——稀釋錯誤此過程也叫復(fù)制后修復(fù)。重組修復(fù)中原損傷沒有除去，若干代后可逐漸稀釋。所需要的酶包括與重組及修復(fù)合成有關(guān)的酶。目前四十二頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點易錯修復(fù)（Error-ProneRepair）SOS反應(yīng)：是細胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的應(yīng)急效應(yīng)。紫外線照射過的E.Coli較未照射過的E.Coli，接受紫外線照射過的λ噬菌體感染時存活率高。SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)系統(tǒng)包括避免差錯修復(fù)(errorfreerepair)和易產(chǎn)生差錯修復(fù).目前四十三頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點逆轉(zhuǎn)錄（ReverseTranscription)以RNA為模板,指導(dǎo)DNA合成的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進行。1964年Temin提出前病毒假設(shè)。1970年Temin和Baltimore同時分別從(雞)勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致癌RNA病毒中分離出反轉(zhuǎn)錄酶1975年，二人獲得諾貝爾獎目前四十四頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制目前四十五頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點逆轉(zhuǎn)錄酶的酶學(xué)性質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性：RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA。目前四十六頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點目前四十七頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點轉(zhuǎn)錄（transcription）

生物體以DNA為模板合成RNA的過程不對稱轉(zhuǎn)錄：DNA片段轉(zhuǎn)錄時，雙鏈DNA中只有一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。原料：四種NTP合成過程:無需引物，連續(xù)，方向：5‘→3’從頭合成目前四十八頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點不對稱轉(zhuǎn)錄指導(dǎo)RNA合成的DNA鏈為模板鏈（負鏈，反意鏈），另一條DNA鏈為編碼鏈（正鏈，有意義鏈）DNA鏈上只有部分的區(qū)段作為轉(zhuǎn)錄模板，且模板鏈并非自始至終位于同一股DNA單鏈上5′···GCAGTACATGTC···3′編碼鏈3′···CGTCATGTACAG···5′模板鏈5′···GCAGUACAUGUC···3′mRNAN······Ala·Val·His·Val······C

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯目前四十九頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點1960年發(fā)現(xiàn)。全酶：α2ββ’σ，其中α2ββ’為核心酶，σ因子識別轉(zhuǎn)錄起始位點。5’→3’聚合活性，無外切酶活性合成起始不需引物RNA聚合酶（E.coli）

目前五十頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點原核生物的轉(zhuǎn)錄起始起始包括對雙鏈DNA特定部位的識別、局部（17bp）解鏈以及在最初兩個核苷酸間形成磷酸二酯鍵。第一個核苷酸摻入的位置稱為轉(zhuǎn)錄起點。σ識別起始位點，RNApol全酶解開雙鏈DNA10～20bp形成轉(zhuǎn)錄空泡。在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。目前五十一頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點E.coli的啟動子(promoter)啟動子：RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。足跡法和DNA測序確定啟動子序列結(jié)構(gòu)。目前五十二頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)PribnowboxTATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335－35序列55RNA聚合酶保護區(qū)結(jié)構(gòu)基因33原核生物啟動子結(jié)構(gòu)－35序列，提供RNA聚合酶識別的信號，pribnowbox，有助于局部解鏈目前五十三頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點目前五十四頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點原核生物轉(zhuǎn)錄的延伸過程σ因子脫落，核心酶變構(gòu)，與模板鏈結(jié)合變松，沿DNA滑動。轉(zhuǎn)錄泡隨核心酶滑動而移動，生成的RNA與DNA模板形成約12bp雜化雙鏈，過長的RNA脫離模板鏈，伸出轉(zhuǎn)錄泡外目前五十五頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點原核生物轉(zhuǎn)錄的終止提供終止信號的DNA序列，稱為終止子核心酶識別終止信號，停止轉(zhuǎn)錄。兩類終止子：依賴和不依賴ρ因子的終止子目前五十六頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點順式作用元件（cis-actingelement）是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識別和結(jié)合的特異DNA序列。包括啟動子、上游啟動子元件、增強子（又稱遠上游信號）、加尾信號和一些反應(yīng)元件等。存在于基因旁側(cè)序列中能影響基因表達的序列，順式作用元件本身不編碼任何蛋白質(zhì)。目前五十七頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點反式作用因子（trans-actingfactor）參與基因表達調(diào)控的因子,通過與特異的靶基因的順式元件結(jié)合起作用。轉(zhuǎn)錄因子:與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的反式作用因子反式作用因子對基因表達的調(diào)控可正(激話)可負(阻遏)。目前五十八頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點真核生物RNA聚合酶種類IIIIII轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物45S-rRNAhnRNA5S-rRNAtRNAsnRNA鵝膏蕈堿耐受極敏感中度敏感利福平不敏感不敏感不敏感亞細胞定位核仁核質(zhì)核質(zhì)目前五十九頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點真核生物轉(zhuǎn)錄啟動啟動子有3類，分別由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種酶進行轉(zhuǎn)錄。啟動子由轉(zhuǎn)錄因子而非RNA聚合酶識別。Ⅰ、Ⅲ的啟動子種類有限，識別所需輔助因子也較少。酶Ⅱ復(fù)雜：基本上由各種順式作用元件組合而成，其分布在轉(zhuǎn)錄起點上游約200bp的范圍內(nèi)。目前六十頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點類別Ⅱ啟動子涉及眾多編碼蛋白質(zhì)的基因的表達。包括：基本啟動子、起始子、上游元件、應(yīng)答元件。基本啟動子：TATA（Goldberg-Hogness)Box基本啟動子是RNA聚合酶和通用因子形成前起始復(fù)合物的主要裝配點。目前六十一頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點起始子TATA盒CAAT盒GC盒增強子轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段

AATAAA切離加尾修飾點外顯子翻譯起始點內(nèi)含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體轉(zhuǎn)錄起始點目前六十二頁\總數(shù)七十一頁\編于十七點POL-ⅡTFⅡFRNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物（PIC）POL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復(fù)合物ⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-PPIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化