第七章外源基因在真核細胞中的表達與調(diào)控

基因工程的基本程序

載體外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主細胞選出含有重組DNA的細胞abbAAb重組DNA的擴增或表達目前一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點基因重組的主要目的是要使目的基因在某一細胞中能得到高效表達，即產(chǎn)生人們所需要的高產(chǎn)目的基因產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、多肽類生物藥物?；蚬こ碳夹g的核心是基因表達技術?；虮磉_是指結(jié)構(gòu)基因在調(diào)控序列的作用下轉(zhuǎn)錄成mRNA，經(jīng)加工后在核糖體的協(xié)助下又轉(zhuǎn)譯出相應的基因產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，再在受體細胞環(huán)境中經(jīng)修飾而顯示出相應的功能。從基因到有功能的產(chǎn)物這整個轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及所有的加工過程就是基因表達的過程，它是在一系列酶和調(diào)控序列的共同作用下完成的。目前二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點一、概述（一）幾個重要的概念1、表達系統(tǒng)（geneexpressionsystem)：

基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括表達載體的構(gòu)建、受體細胞的建立及表達產(chǎn)物的分離、純化。目前三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點2、據(jù)受體細胞的不同可分為：1）原核表達系統(tǒng)：

將外源基因引入原核細胞，并使其在原核細胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達、合成基因產(chǎn)物的體系。2）真核表達系統(tǒng)：

使外源基因在真核細胞中表達的體系。目前五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（二）原核表達系統(tǒng)的局限性

1.缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)，不能進行糖基化、甲基化的修飾，影響某些蛋白的活性。2.在原核細胞中表達的真核蛋白不穩(wěn)定，易被細菌蛋白酶降解。3.很難實現(xiàn)真正的分泌出胞，其產(chǎn)量很低，而且容易出現(xiàn)信號肽不被切割，或不在特異位置上切割。4.表達產(chǎn)物常以包涵體（防止蛋白酶的水解）的形式存在，后期需要經(jīng)過變性（鹽酸胍或尿素）復性（二硫蘇糖醇、巰基乙醇等還原劑），并且復性效率低。5.內(nèi)毒素的污染目前六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點真核基因組結(jié)構(gòu)復雜龐大:形成復雜的染色質(zhì)或者染色體基因不連續(xù)性:內(nèi)含子、外顯子3.含有大量的重復序列：低度、中度或高度4.存在許多基因家族（有一定同源性而又不完全相同的基因簇）：如珠蛋白基因家族、ras基因家族等。5.沒有原核細胞的操縱子，不產(chǎn)生多順反子mRNA:即一個編碼基因轉(zhuǎn)錄生成一個mRNA分子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈(單順反子mRNA）。6.基因表達調(diào)控復雜（三）真核基因組結(jié)構(gòu)特點目前七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點(a)原核生物mRNA為多順反子(b)真核生物mRNA為單順反子目前八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（四）真核基因表達調(diào)控特點——多方面、多層次1.轉(zhuǎn)錄前（基因組水平）調(diào)控：基因結(jié)構(gòu)改變，持久且不可逆2.轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：3.轉(zhuǎn)錄后修飾：4.翻譯水平的調(diào)控：5.翻譯后修飾：目前十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點轉(zhuǎn)錄前調(diào)控1.基因丟失：目前認為這種調(diào)節(jié)方式主要是在較低等的真核生物中。2.基因擴增：是指某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象。3.基因重排：是指某些基因片段改變原來存在的順序而重新排列組合。4.甲基化修飾：DNA甲基化是一種重要的基因組表觀遺傳修飾，參與調(diào)控許多細胞過程，包括胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因組印跡以及染色體穩(wěn)定性。5.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因表達的調(diào)控：細胞分裂時松開分散在核內(nèi)的染色質(zhì)稱為常染色質(zhì)，常染色質(zhì)的基因可以轉(zhuǎn)錄。染色體中的某些區(qū)段到分裂期后，仍保持緊湊折疊的結(jié)構(gòu)，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質(zhì)，基因不能轉(zhuǎn)錄表達。目前十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控1.RNA聚合酶:I,II,III2.順式調(diào)控因子（cis-actingfactor)3.反式作用因子（trans-actingfactor)目前十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點酶主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA聚合酶ⅠrRNA，大多數(shù)snRNARNA聚合酶ⅡmRNA前體，部分snRNARNA聚合酶ⅢtRNA、部分snRNA

真核細胞中RNA聚合酶的種類目前十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點順式調(diào)控因子順式調(diào)控因子（cis-actingfactor)：是與結(jié)構(gòu)基因串連的、對基因轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄活性具重要調(diào)控作用的特定DNA序列。包括正性調(diào)控元件（啟動子、增強子）和負性調(diào)控元件（沉寂子、加尾和轉(zhuǎn)錄終止信號）目前十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點啟動子啟動子（Promoter）:位于基因的5'端與基因轉(zhuǎn)錄起始有關的核苷酸序列。一般包括轉(zhuǎn)錄起始點及其上游100-200bp序列作用特點：近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定分類：核心啟動子元件（轉(zhuǎn)錄起始點上游-30bp區(qū)的TATA-box）：決定基因轉(zhuǎn)錄精確起始。上游啟動子元件(包括：-70至-80bp區(qū)域的CAAT盒及其兩側(cè)的GC盒):協(xié)同決定轉(zhuǎn)錄基礎效率。組織特異性元件:如肝細胞特異性啟動子元件HP1，與白蛋白、AFP等基因在肝細胞中的特異性表達有關。誘導性啟動子元件：如cAMP反應元件（CRE），介導對cAMP、生長因子等信號的反應。目前十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點

啟動子結(jié)構(gòu)模式圖

SP1NF1

SP1TBP目前十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點表－1哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中

常見的元件元件名稱共同序列結(jié)合的蛋白因子名稱分子量DNA長度TATATATAAATFIID30,000～10bpGCGGGCGGSP-1105,000～20bpCAATGGCCAATCTCTF/NF160,000～22bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000～10bpATFGTGACGTATF?~20bpOctaneATTTGCATOct-176,000～10bp目前十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點增強子增強子(Enhancer):是一類本身不具備啟動子活性但能夠促進轉(zhuǎn)錄活性的順式調(diào)控元件。構(gòu)成：由單拷貝或多拷貝組件串連構(gòu)成，長100-200bp，核心組件8-12bp。作用特點：遠距離作用無方向性有啟動子依賴性，但對啟動子無嚴格專一性，因而無基因特異性。組織特異性相位性目前二十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前二十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點負性調(diào)控元件沉寂子（silencer)或衰減子(dehancer)：是一類抑制基因轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)控元件，作用方式同增強子。轉(zhuǎn)錄終止信號：加尾信號：AATAA,polyA上游10-20bpG/T簇：能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復序列目前二十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前二十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點反式作用因子反式作用因子（Trans-actingfactor）:由位于不同或相同染色體上相距較遠的基因所編碼的蛋白質(zhì)因子，通過與順式調(diào)控元件和RNA聚合酶的相互作用而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。目前二十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點轉(zhuǎn)錄信號1PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA結(jié)合蛋白）Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinB目前二十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點反式作用因子可以分為3類：（1）普通轉(zhuǎn)錄因子（通用轉(zhuǎn)錄因子）：主要識別啟動子的核心啟動成分，如TATA盒結(jié)合因子TFIID；（2）組織特異性轉(zhuǎn)錄因子：是特殊組織與細胞中的反式作用因子，如淋巴細胞中的Oct-2；（3）誘導性反式作用因子：與反應性元件（responseelements）相結(jié)合的反式作用因子。如HSRE（熱休克反應元件，heatshockresponseelement）

GRE（糖皮質(zhì)激素反應元件，glucocorticoidresponseelement）

CRE（cAMP反應元件，cAMPresponseelement）

目前二十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點反式作用因子的結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄激活域TF富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域酸性α-螺旋結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域同源結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈螺旋-環(huán)-螺旋螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋目前二十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點螺旋轉(zhuǎn)角螺旋鋅指結(jié)構(gòu)亮氨基拉鏈螺旋環(huán)螺旋同源結(jié)構(gòu)域SP1OCT-2AP-1myc目前二十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前二十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點1、RNA加工成熟：無論是rRNA、tRNA、mRNA，轉(zhuǎn)錄后都必須經(jīng)過加工，才能成為有功能的分子。rRNA：前體是45S，成熟的rRNA是18S、28S、5.8S，還要經(jīng)過化學修飾--核糖甲基化。tRNA：首先經(jīng)過核苷的修飾，生成4.5S前體tRNA，再剪接成為成熟的tRNA。mRNA：5’加帽子，3’加poly(A)，還要經(jīng)過剪接以及核苷酸的甲基化修飾。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控目前三十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前三十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點

真核生物的基因可以分為兩大類：一類是簡單的轉(zhuǎn)錄單位；另一類是復雜轉(zhuǎn)錄單位。轉(zhuǎn)錄后加工方式是不同的。（1）簡單轉(zhuǎn)錄單位：編碼產(chǎn)生一個多肽，轉(zhuǎn)錄后加工有3種形式。a、基因沒有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后無需加工，也沒有poly(A),如組蛋白基因。b、沒有內(nèi)含子，無需剪切，但需要加poly(A)尾，如α-干擾素基因。c、有內(nèi)含子，需要加工，及加poly(A)尾，但它們只產(chǎn)生一個有功能的mRNA，如ɑ,β-珠蛋白基因。2、轉(zhuǎn)錄后加工的多樣性目前三十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前三十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過不同的方式加工成兩個或兩個以上的mRNA。a、利用多個轉(zhuǎn)錄起始點或剪接位點產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。b、利用多個加多聚（A）位點和不同的剪切方式產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。c、雖無剪接，但有多個轉(zhuǎn)錄起始位點或加poly(A)位點。

（2）復雜轉(zhuǎn)錄單位目前三十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點利用多個轉(zhuǎn)錄起始點或剪接位點產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)目前三十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前三十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點利用多個加多聚（A）位點和不同的剪切方式產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)目前三十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點雖無剪接，但有多個轉(zhuǎn)錄起始位點或加poly(A)位點目前三十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點翻譯水平的調(diào)控對可溶性蛋白質(zhì)因子的修飾：如eIF-2磷酸化后可抑制蛋白質(zhì)的合成。對mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)反義RNA對翻譯的調(diào)控作用反義RNA(anti-sense)：一段含有與被調(diào)控基因所產(chǎn)生mRNA互補的堿基序列的小分子RNA。①與mRNA結(jié)合，形成雙鏈RNA。影響mRNA的模板效率；②可能參與mRNA的拼接。目前三十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前四十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點1.多肽的切割：切去前端的信號肽2.多肽的有限水解：蛋白質(zhì)（酶原）必須經(jīng)過有限的酶和化學水解才能變成有活性的物質(zhì)。3.多肽的化學修飾：蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化（糖蛋白）、乙?；?.多肽的剪接：多肽被剪接成數(shù)個片段，再以一定的順序結(jié)合起來，形成有活性的蛋白質(zhì)。翻譯后的調(diào)控目前四十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點二、真核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)（Eukaryoticexpressionsystem)：指在真核細胞中表達外源基因的體系。組成：真核表達載體受體細胞基因轉(zhuǎn)移方式目前四十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（一）真核表達系統(tǒng)的必要性和優(yōu)勢1.具有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)：剪除內(nèi)含子2.具有完善的翻譯后加工系統(tǒng)：對表達蛋白進行修飾，具有天然構(gòu)型。3.可實現(xiàn)分泌表達:將表達產(chǎn)物分泌至細胞外培養(yǎng)液，簡化了純化工藝。4.有助于深入了解真核基因表達調(diào)控機制,實現(xiàn)基因治療。目前四十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（二）真核表達載體真核表達載體：適用于在真核細胞中表達外源基因的載體。真核載體根據(jù)受體不同，可分為：酵母表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲桿狀病毒表達載體。目前四十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點

真核表達載體包括在大腸桿菌中起作用的復制起始位點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。真核表達載體中還具有：①真核表達調(diào)控元件：包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列、polyA加尾信號等②真核細胞復制起始序列③真核細胞藥物抗性基因目前四十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點真核表達載體帶有的polyA加尾信號可保證新轉(zhuǎn)錄的mRNA能有效地加上polyA。真核表達載體的基本組成

OriPro：原核復制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復制起始序列。注：不是所有真核表達載體都有整合序列PolyA目前四十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（三）真核表達系統(tǒng)1.酵母表達系統(tǒng)：利用酵母表達載體，在酵母細胞中表達外源基因2.哺乳動物細胞表達系統(tǒng)：利用重組質(zhì)?；虿《据d體，在哺乳動物細胞內(nèi)表達外源基因3.昆蟲細胞表達系統(tǒng)：利用昆蟲桿狀病毒表達載體，在昆蟲細胞內(nèi)表達外源基因目前四十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點

酵母表達系統(tǒng)

目前四十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點特點及優(yōu)勢

酵母菌是單細胞真核生物，其遺傳背景清楚培養(yǎng)簡單，生長周期短，經(jīng)濟生物安全性高可分泌表達，簡化純化工藝目前四十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（一）酵母載體在酵母細胞中復制、擴增和表達的載體，包括克隆載體和表達載體。主要組成元件：篩選標記：如抗生素抗性基因Zeocin(博來霉素,屬于爭光霉素家族的成員）營養(yǎng)缺陷標記基因Leu(β異丙基蘋果酸脫氫酶,參與丙酮酸向亮氨酸的轉(zhuǎn)化)

目前五十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點

Leu-作為酵母載體的選擇標記基因目前五十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點用于酵母載體中的調(diào)控序列ARS（AutoReplicationSequence)：自主復制序列，為酵母復制起始區(qū)(點)。2μM質(zhì)粒：酵母核質(zhì)中的小的環(huán)狀DNA，可以獨立復制并轉(zhuǎn)錄。酵母啟動子：常用的有GAP（3-磷酸甘油醛脫氫酶）、AOX1（醇氧化酶-1）、ADH(乙醇脫氫酶)、SUC(蔗糖酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、Apase(堿性磷酸酶)啟動子。酵母著絲粒區(qū)段(CEN)：增加轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性。目前五十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點酵母載體的種類酵母克隆載體：不含酵母啟動子，不能在酵母中表達外源基因，如YIP、YRP、YEP酵母表達載體：酵母克隆載體+酵母啟動子,若引入信號肽序列，則成為分泌型載體YAC：酵母人工染色體（yeastartificialchromosome)可插入200～800kb的外源基因片段，因而特別適合高等真核生物基因組的克隆與表達研究。目前五十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點1.YIp(酵母整合型質(zhì)粒)：細菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標記，通過同源重組整合入酵母染色體，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)化率極低。2.YRp(酵母復制型質(zhì)粒)：細菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標記(YIp)+酵母復制序列(ARS),可自主復制，但穩(wěn)定性差。3.YEp(酵母附加子型質(zhì)粒)：細菌質(zhì)粒DNA+酵母標記基因(YIp)+酵母2μM質(zhì)粒，游離于核外存在并自主復制。I.酵母克隆載體目前五十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點

酵母克隆載體的構(gòu)建目前五十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點II.酵母表達載體含酵母啟動子穿梭載體(shuttlevector)：既可以攜帶外源基因在原核細胞中復制增殖，又可以在真核細胞中表達外源基因的載體。種類：釀酒酵母表達載體畢赤酵母表達載體分泌型表達載體：引入酵母的信號肽基因，如因子信號肽目前五十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點釀酒酵母表達載體Leu2編碼β異丙基蘋果酸脫氫酶，作為篩選標記。帶有此質(zhì)粒的酵母菌在不含有亮氨酸的培養(yǎng)基中能生長。目前五十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點畢赤酵母表達載體整合型HIS4編碼組氨醇脫氫酶基因，作為篩選標記。HIS4區(qū)的整合方式為位點特異性單交換引起的基因插入，整合后使營養(yǎng)缺陷型宿主恢復野生型，在不含組氨酸的培養(yǎng)基上能生長。目前五十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點5‘AOX1啟動子片段含有AOX1啟動子，在甲醇的誘導下可啟動外源蛋白的表達；α-因子信號肽序列為約89個氨基酸的信號肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；多克隆位點含多個酶切位點，為外源基因的插入提供位點；TT序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號；HIS4為營養(yǎng)缺陷型篩選標志；3‘AOX1基因片段能夠與基因組AOX1基因?qū)偻粗亟M；抗Amp基因和pBR322能使空載體和構(gòu)建的表達載體在E.coli中篩選和復制。以應用于畢赤酵母表達系統(tǒng)的pPIC9載體為例解釋載體的構(gòu)件目前五十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點畢赤酵母分泌型表達載體啟動外源基因的啟動子：PGAPPTEF1PEMT，MCS：多克隆位點鑒定的標記：6╳His，myc.終止子：AOX1TT，CYC1TT抗生素篩選標記：zeocin.復制起始位點：pUCori目前六十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點III.酵母人工染色體（YAC）YAC:利用酵母的著絲粒序列（CEN）、酵母復制起始區(qū)（ARS）及端粒重復序列（TEL）構(gòu)建的人工染色體結(jié)構(gòu)：左臂：TEL、選擇標記、ARS、CEN右臂：TEL、選擇標記特點：容量大（200-800kb），穩(wěn)定性差作用：構(gòu)建基因組文庫目前六十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點

YAC載體中最常用的是pYAC4篩選標記:His3:組氨酸合成缺陷性標記URA3:尿嘧啶合成缺陷性標記SUP4:赭石突變(ade2-1)抑制基因sup4目前六十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前六十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（二）受體細胞1、釀酒酵母：它具有作為宿主菌必須具備的許多條件，是最早應用于外源基因克隆和表達的酵母菌。目前已表達了諸如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細胞集落刺激因子等多種外源基因產(chǎn)物。其缺點是在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乙醇，影響酵母的生長代謝和基因產(chǎn)物的表達。此外，釀酒酵母在蛋白質(zhì)的加工過程中會發(fā)生過度糖基化作用，其分泌表達能力也有待提高。目前六十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點表1-3在釀酒酵母中表達的重組蛋白種類名稱疫苗乙肝病毒表面抗原，瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白，HIV－1外殼蛋白診斷試劑丙肝病毒蛋白，HIV－1抗原人類治療用蛋白藥物上皮生長因子，胰島素，類胰島素生長因子，血小板源生長因子，胰島素前體，成纖細胞生長因子，集落刺激因子，α1抗胰蛋白酶，凝血因子XⅢa目前六十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點2、畢赤酵母：新發(fā)展的酵母受體細胞高表達（12mg/L）：AOX1啟動子或GAP啟動子高穩(wěn)定性：載體為整合型高分泌（10mg/L）：因子信號肽基因

在畢赤酵母中得到表達的重組異源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人腫瘤壞死因子、人表皮生長因子、鏈激酶等幾十種。畢赤酵母的分泌表達能力比釀酒酵母強，但對其遺傳背景了解還比較少，且發(fā)酵周期也比較長。目前六十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（三）轉(zhuǎn)化①鋰鹽法；②PEG法；③原生質(zhì)球法；④電穿孔法。

電穿孔法：效率較高,應用最廣整合型載體轉(zhuǎn)化前要酶切線性化目前六十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（四）外源基因在酵母菌中的表達1、胞內(nèi)表達：直接表達外源基因

2、分泌表達：在MCS前加入信號肽序列pGAPZ,利用因子分泌表達目前六十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前六十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前七十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點人Endostatin基因的克隆、表達中國人胎肝總RNAEndostatincDNApGEM-T載體T-A克隆RT-PCR重組endostatin克隆載體pGAPZaA載體重組endostatin表達載體電轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌ZeocinSDS陽性重組子目前七十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前七十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點重組Endostatin的初步純化與抑制作用研究陽性重組子大量擴增、表達endostatin蛋白培養(yǎng)上清超濾濃縮SepharoseG25去鹽Heparin親和層析初步純化的重組endostatin蛋白濃縮液透析抑制作用研究體外作用ECV304細胞HepG2.2.15細胞體內(nèi)作用裸鼠人肝癌模型兔角膜新生血管目前七十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（五）高表達的策略1.利用誘導型強啟動子2.提高整合拷貝數(shù)3.控制蛋白酶降解活性4.分泌表達目前七十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（六）缺點不能實現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能目前七十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點哺乳動物細胞表達系統(tǒng)目前七十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點優(yōu)點進行完全的翻譯后修飾可表達產(chǎn)生有功能的膜蛋白用途：表達大量的外源蛋白研究基因的功能基因治療

有效選擇轉(zhuǎn)化細胞，要求載體具備明顯的標記基因目前七十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（一）幾種常用的哺乳動物表達系統(tǒng)的選擇標記基因1、胸苷激酶(tk)基因2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因3、新霉素抗性基因(neo)、4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因檢測系統(tǒng)5、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因目前七十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點1、胸苷激酶（tk）基因胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核細胞中都有表達,是嘧啶生物合成補救代謝途徑中的一個關鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與DNA的生物合成。目前七十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點tk+細胞中：胸苷(T)→胸苷-磷酸→TTP二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP

氨基喋呤(Aminopterin)

tk阻斷補加次黃嘌呤（H）死亡存活補救合成目前八十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點胸苷激酶(tk)基因HAT選擇法原理攜帶外源基因的載體連接有tk基因，可以表達胸苷激酶以tk－細胞為受體細胞在HAT（次黃嘌呤－氨基喋呤－胸苷）選擇培養(yǎng)基中，只有外源基因轉(zhuǎn)化成功的tk+細胞存活，tk-細胞死亡則陽性重組子在HAT中篩選出來目前八十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP

氨基蝶呤氨甲喋呤阻斷目前八十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點二氫葉酸還原酶基因篩選法原理

攜帶外源基因的載體連接有dhfr基因，可以表達二氫葉酸還原酶以dhfr-細胞為受體：CHO細胞dhfr-細胞無法在普通培養(yǎng)基中存活，而轉(zhuǎn)化入dhfr基因后可以存活，并表達外源基因。若在培養(yǎng)基內(nèi)加入氨甲蝶呤，進行加壓篩選，可以提高外源基因表達量。目前八十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點3、新霉素抗性基因(neo)新霉素的類似物G418（gentamycin）對原核、真核細胞均有毒性。攜帶外源基因的載體連接有neo基因，neo編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶可滅活G418，因而，只有轉(zhuǎn)化入neo基因的細胞才能夠在含有G418的培養(yǎng)基中存活。此種篩選方法要求載體攜帶neo基因，而對受體細胞無要求，應用更為簡便。目前八十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因檢測系統(tǒng)

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Cat）是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9編碼的。Cat可催化氯霉素發(fā)生乙?；饔?，使其實去活性。雖然真核細胞不含有內(nèi)源性的Cat酶活性，但真核細胞的啟動子可引發(fā)外源性Cat基因的表達。目前八十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點以Cat基因作為選擇標記的原理將帶有Cat基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到哺乳動物細胞后，就會合成Cat。哺乳動物細胞本身不能合成Cat，所以只要在轉(zhuǎn)化的細胞中檢測到Cat的活性，即可肯定它是來自外源的Cat質(zhì)粒。特別適用于瞬時表達的研究。目前八十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點5、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因XGPRT是由大腸桿菌Ecogpt基因編碼的一種核苷酸代謝酶，哺乳動物細胞無XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤核苷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤核苷酸（IMP）。哺乳動物細胞可通過IMP生成GMP。當用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細胞失去合成DNA能力而死亡。目前八十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）

基因篩選法原理將含XGPRT基因的重組體導入真核細胞后，在轉(zhuǎn)化細胞中就能表達XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過XMP中間體補救合成GMP，使DNA合成正常進行。加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未轉(zhuǎn)化的陰性細胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用來篩選陽性細胞。目前八十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前八十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（二）外源基因?qū)氩溉閯游?/p>

細胞的載體質(zhì)粒型(非病毒型)載體病毒型載體目前九十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點啟動子：病毒來源的：SV40、CMV、RSV細胞來源的：HSP、MCK（肌酸激酶）增強子:來源于SV40、RSV、CMV（在不同種屬細胞中都有極強的促進轉(zhuǎn)錄能力）篩選標記原核序列：復制子及篩選標記真核復制起始點：提高外源基因表達水平轉(zhuǎn)錄終止信號和多聚腺苷酸化信號

哺乳動物細胞表達載體的主要元件目前九十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點1.質(zhì)粒型載體由真核復制信號、啟動子、轉(zhuǎn)錄單位及質(zhì)粒片段組成,不需要包裝細胞。如：pcDNA3、pVAX1、pEGFP-N1等。目前九十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前九十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點BGH：BovineGrowthHormone目前九十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點pVAX1的特點不僅具有在大腸桿菌中高拷貝復制和在多數(shù)哺乳類動物細胞中高效表達蛋白的特點,而且pVAX1具有卡那霉素抗性,在人體內(nèi)產(chǎn)生變應反應者較少。pVAX1是由美國食品和藥品管理委員會（FDA）推薦的唯一可以應用于人體實驗的載體質(zhì)粒。迄今為止，關于pVAX1的研究已涉及動物和臨床試驗。目前九十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前九十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點pEGFP-N1載體具有以下幾方面特點：

①從結(jié)構(gòu)上看，該質(zhì)粒具有很強的復制能力，可以滿足隨宿主細胞分裂時跟隨胞質(zhì)遺傳給新生的子細胞，這是保證目的基因穩(wěn)定表達的因素之一；

②含有高效的功能強大的啟動子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的細胞中穩(wěn)定表達；

③具有多克隆位點，便于目的基因的插入；

④該載體具有neo基因，可以采用G418來篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體的靶細胞。

這些特殊的結(jié)構(gòu)可以實現(xiàn)目的基因在靶細胞內(nèi)的穩(wěn)定表達。

目前九十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點GFP的相關知識：

綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)基因來源于JellyfishAequoreaVictoria，是Shimomura等于1962年發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，由238個氨基酸組成，分子量約為27Kd。GFP在包括熱、極端PH和化學變性劑等苛刻條件下都很穩(wěn)定，用甲醛固定后會持續(xù)發(fā)出熒光，但在還原環(huán)境下熒光會很快熄滅。

目前九十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點與以往常用的報告基因相比，GFP具有以下優(yōu)點：

①在熒光顯微鏡下，用波長約490nm的紫外線激發(fā)后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測；

②無需任何的作用底物或共作用物,檢測的靈敏度不受反應效率的影響，保證了極高的檢出率；

③蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定；

④可在多種異源生物中表達且無細胞毒性；

⑤其基因片段長度較小(約717bp)，易于構(gòu)建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性，為研究其他基因表達產(chǎn)物的分布提供了方便。

目前九十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點EGFP是一種優(yōu)化的突變型GFP，使其產(chǎn)生的熒光較普通GFP強35倍，大大增強了其報告基因的敏感度。EGFP與其他蛋白的融合表達已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影響其發(fā)光。

目前一百頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點2.病毒型載體外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重組DNA隨病毒顆粒而復制(多需輔助病毒或包裝細胞的存在)。如：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等目前一百零一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點病毒型載體的類型整合型整合入宿主染色體，隨染色體復制而復制可持續(xù)表達外源基因安全性低：插入誘變SV40載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，腺相關病毒載體游離型不整合生物安全性高瞬時表達腺病毒載體，痘苗病毒載體目前一百零二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點SV40(猴空泡病毒40)載體dsDNA病毒，基因組約5.2kb基因結(jié)構(gòu)清楚,含有整套基因表達調(diào)控序列早期區(qū)：T、t抗原（腫瘤蛋白質(zhì)或抗原）T抗原是細胞轉(zhuǎn)化的啟動所必須的。t抗原對于細胞的轉(zhuǎn)化不是必需的，但可起加強作用。

晚期區(qū)：產(chǎn)生病毒衣殼蛋白（VP1，VP2及VP3)，包裝病毒顆粒所必需復制起始位點：早、晚區(qū)基因之間目前一百零三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前一百零四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點特點載體構(gòu)建：早期取代晚期取代天然SV40載體宿主范圍窄，容量小（2.5kb）易形成野生型病毒溶源生長：導致宿主細胞裂解死亡故較少使用，做瞬時轉(zhuǎn)染用（轉(zhuǎn)化COS細胞），或利用其調(diào)控元件。pSV系列由SV40派生的一系列質(zhì)粒型載體目前一百零五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前一百零六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前一百零七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(RV)

基因組結(jié)構(gòu)：ssRNA(9.2kb)LTRgagpolenvLTRφLTR（longterminalrepeat）:長末端重復序列,含啟動子和polyA信號,介導病毒整合。φ包裝信號：是包裝病毒顆粒時所必須的非編碼序列。結(jié)構(gòu)蛋白：核心蛋白(gag)、逆轉(zhuǎn)錄酶（pol)、衣殼蛋白(env)。目前一百零八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前一百零九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點逆轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體pLXSNMCS目前一百一十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點載體元件：LTR、標記基因及質(zhì)粒部分組成逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)包括：一個含有目的基因的表達載體；一個編碼VSV-G（皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G，是一種包膜蛋白，具有廣泛的宿主范圍）的輔助質(zhì)粒；表達gag/pol的輔助質(zhì)粒；293T（人胚腎細胞）包裝細胞。

目前一百一十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點優(yōu)點：宿主范圍廣，能感染多種動物和人類的不同類型的細胞而無嚴格的組織特異性；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠高效地感染分裂的宿主細胞，感染細胞后能夠?qū)⑤d體基因組穩(wěn)定整合到宿主基因組的隨機位點上，使目的基因長期穩(wěn)定表達。逆轉(zhuǎn)錄病毒的免疫原性較低。缺點：只能感染分裂細胞，而不能感染非分裂細胞；能夠插人的外源基因較小(7～8kb)，難以滿足較大基因的轉(zhuǎn)移；載體DNA整合人宿主染色體是隨機的，并因隨機整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，從而具有引發(fā)癌癥的風險；

目前一百一十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目的基因

RV穿梭載體

包裝細胞系重組RV載體E．coli大量擴增病毒載體DNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒受體細胞

表達蛋白，研究宿主細胞性狀克隆共轉(zhuǎn)染感染轉(zhuǎn)化輔助質(zhì)粒篩選、擴增目前一百一十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點

慢病毒載體（lentivirus）屬逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，是一類非鼠源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，以人類免疫缺陷病毒（HIV）為代表。慢病毒源性載體（lentivirus-basedvector，LV）：能將外源基因整合入非分裂細胞的基因組內(nèi)。無明顯免疫反應，長期的轉(zhuǎn)基因表達。具有嚴格的宿主范圍、滴度低及HIV-1獨特的致病性，限制了它作為轉(zhuǎn)基因載體的應用。主要應用于轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，效果好于腺相關病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

目前一百一十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前一百一十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點腺相關病毒載體（AAV）腺相關病毒：Adeno-AssociatedVirus，AAV線狀單鏈DNA病毒，4.7kb，缺陷型非病原性人類細小病毒，只有與腺病毒、單純皰疹病毒等共感染時才能進行有效復制。感染細胞范圍廣，可感染分裂期與分裂后期細胞野生型病毒可定點整合人類19號染色體長臂，基因表達穩(wěn)定;

目前一百一十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點缺點外源基因插入容量小（5kb以下）感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒低制備滴度低存在一定的免疫反應主要應用于轉(zhuǎn)染骨骼肌、視網(wǎng)膜、肝細胞、神經(jīng)元細胞等目前一百一十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點腺病毒（Ad）載體基因結(jié)構(gòu)：dsDNA,線性，36kbφE1A

E1BL1E3E2AE2BE4Φ：包裝信號E1—E4:結(jié)構(gòu)蛋白目前一百一十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點載體構(gòu)建：取代結(jié)構(gòu)基因特點：安全性高(人為自然宿主，不整合)滴度高（1011pfu/ml）容量大（--36kb)可感染非分裂細胞可直接體內(nèi)應用，原位感染組織是目前基因治療的最常用載體缺點：免疫原性高，表達時間短無組織特異性真核細胞內(nèi)篩選復雜，費時目前一百一十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點AdEasy-1systemAdEasy-1system具有以下優(yōu)點：1.效率高：可以感染分裂期與靜止期細胞2.篩選方便：帶有目的基因的穿梭載體與病毒骨架質(zhì)粒的同源重組發(fā)生于原核細胞（如細菌）內(nèi)。3.生物安全性高：不整合4.插入容量大目前一百二十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點AdEasy-1system包括：腺病毒穿梭載體：可連接外源基因骨架質(zhì)粒：含有腺病毒大部分結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒，pAdEasy-1受體細胞：E.coliBJ5183包裝細胞：轉(zhuǎn)入E1或E4基因區(qū)的HEK293（人胚腎細胞）或911細胞（人胚視網(wǎng)膜細胞）目前一百二十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點穿梭載體目前一百二十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目前一百二十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點痘苗病毒載體容量大安全性好：長期用作預防天花的疫苗可用來構(gòu)建多價疫苗

目前一百二十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點常用的病毒載體的特點：目前一百二十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（三）受體細胞1、CHO細胞（中國倉鼠卵巢癌細胞）可穩(wěn)定表達外源基因，并可大規(guī)模生產(chǎn)藥物、抗體及診斷試劑，被美國FDA確認為基因工程受體細胞。2、COS細胞（猴腎細胞系）能瞬時大量表達外源蛋白，是進行外源基因瞬時表達時用途最廣的宿主細胞。3、其他細胞：如腫瘤細胞Hela(人宮頸癌細胞）等。目前一百二十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點（四）重組載體導入細胞的方法目前一百二十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點1.病毒感染：借用病毒的感染方式，將外源基因事先插入到病毒的基因組中，并用適當?shù)姆绞桨b成有感染活性的重組病毒顆粒，用于感染細胞，從而將外源病毒導入到相應的細胞中。常用：逆轉(zhuǎn)錄病毒；腺病毒；皰疹病毒等。優(yōu)點：整和效率高,可使外源基因在宿主細胞中長期表達,適用于難以轉(zhuǎn)染的原代細胞。缺點：重組病毒建立有一定難度；存在潛在的安全危險性。目前一百二十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點目的基因

AdV穿梭載體

包裝細胞HEK293

重組AdV載體E．coli

BJ5183同源重組陽性的腺病毒基因組載體DNA重組rAd病毒顆粒受體細胞

表達蛋白，研究宿主細胞性狀克隆轉(zhuǎn)染感染骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化E．coli

擴增轉(zhuǎn)化Ecoli擴增目前一百二十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點圖1：復制缺陷型重組腺病毒載體制備原理圖圖2輔助病毒依賴型腺病毒載體制備示意圖目前一百三十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點2.轉(zhuǎn)染：外源DNA導入到細胞中的非病毒方法，通常稱為轉(zhuǎn)染。分化學方法和物理方法。理想的轉(zhuǎn)染方法：操作簡單、高效、低毒、對細胞正常生理狀況影響小、重復性好、成本低。磷酸鈣共沉淀法陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染受體介導的基因轉(zhuǎn)移電穿孔顯微注射基因槍目前一百三十一頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點Atypicalmammalianexpressionvectorforhigh-levelproteinexpression目前一百三十二頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣有利于促進外源DNA與靶細胞表面結(jié)合,氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混和,形成極小的磷酸鈣-DNA復合物沉淀黏附在細胞膜表面,借助內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染的成功至關重要。目前一百三十三頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點磷酸鈣共沉淀法的優(yōu)缺點優(yōu)點：能用于任何DNA導入哺乳類動物,瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。缺點：轉(zhuǎn)染效率低：進入細胞的DNA只有１％－５％可以進入細胞核,其中只有不到１％的DNA可以與細胞DNA整合,在細胞中進行穩(wěn)定表達。重復性不佳：pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應時間、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。目前一百三十四頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)移法中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內(nèi)。

目前一百三十五頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點帶正電的陽離子脂質(zhì)體,DNA并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導入細胞。目前一百三十六頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點脂質(zhì)體介導方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：適用于把ＤＮＡ轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞,可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染效率高,比磷酸鈣法高5-100倍；能夠把ＤＮＡ和ＲＮＡ轉(zhuǎn)染到各種細胞,轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性好,可重復性高,轉(zhuǎn)染時最好不加血清和抗生素。缺點：陽離子脂質(zhì)體細胞毒性相對較高,對部分細胞可能會干擾細胞的代謝。目前一百三十七頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點受體介導的基因轉(zhuǎn)移

配體寡肽E5針對細胞表面受體（IGFRI，II）HA20流感病毒血凝素功能域20肽，作為內(nèi)吞小體釋放寡肽多聚陽離子多肽PCP多聚賴氨酸（PL）攜帶外源基因的質(zhì)粒DNA目前一百三十八頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點質(zhì)粒DNAE5-PCP-PLHA20-PCP-PLHA20：破壞溶酶體膜E5：特異性導入肝癌細胞吞噬溶酶體目前一百三十九頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點電穿孔介導基因轉(zhuǎn)移法

靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞.

目前一百四十頁\總數(shù)一百五十七頁\編于十四點電穿孔法的優(yōu)缺點優(yōu)點：轉(zhuǎn)染效率較高缺點：需要昂貴的儀器（電穿孔儀）；對細胞的損傷較大,每次轉(zhuǎn)染需要更多的細胞和DN