第三部分微生物生長

第三部分微生物生長第1頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)微生物純培養(yǎng)分離及生長測定方法第2頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三一、獲得純培養(yǎng)的方法純培養(yǎng)(pureculture)微生物學(xué)中把從一個細胞或一群相同的細胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代,稱純培養(yǎng).（1）液體稀釋法（2）平板劃線分離法（StreakPlate）（3）平板涂布分離法（SpreadPlate）（4）選擇性培養(yǎng)分離法（5）單細胞（單孢子）分離法第3頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三首先將待分離的樣品進行連續(xù)稀釋,目的是得到高度稀釋的效果,使一支試管中分配不到一個微生物.如果經(jīng)過稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長,那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是由一個微生物個體繁殖而來的純培養(yǎng)物.這種方法適合于細胞較大的微生物.（1）液體稀釋法第4頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三（2）平板劃線分離法（StreakPlate）特點：快速、方便。

分區(qū)劃線（適用于濃度較大的樣品）

連續(xù)劃線（適用于濃度較小的樣品）Aninoculatingloopisusedtothinoutorganismsonthesurfaceoftheagar.第5頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三（3）平板涂布分離法（SpreadPlate）簡單易行，但易造成機械損傷Liquidspecimenisspreadonthesurfaceofsolidagarwithasterilebentglassrod.第6頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三（4）選擇性培養(yǎng)分離法為了從混雜的微生物群體中分離出某種微生物，可以根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)的方法進行分離。第7頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三（5）單細胞（單孢子）分離法采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進行。毛細管法：用毛細管提取微生物個體，適合于較大微生物。顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個細胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。小液滴法：將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個細胞的液滴來進行純培養(yǎng)物的分離。第8頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三二、微生物生長量的測定方法（一）微生物細胞數(shù)目的檢測法1?？偩鷶?shù)的測定（計數(shù)器直接計數(shù)，染色涂片計數(shù)，比濁法）2?；罹鷶?shù)的測定（平板計數(shù)法、液體稀釋法、膜過濾法）第9頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三（二）微生物生長量的測定1。直接法(干重法，體積法)2。間接法（比濁法，碳、氮含量法，DNA測定法等）第10頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三1.血球計數(shù)板法第11頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三原理：將1mm2×0.02mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80小格，計數(shù)其中的細胞數(shù)目，換算成單位體積中的細胞數(shù)。適用范圍：個體較大細胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細菌等個體較小的細胞，因為（1）細菌細胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。特點：快速，準確，對酵母菌可同時測定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍可以區(qū)分死活細胞。第12頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三2.涂片染色法應(yīng)用：可同時計數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適于土壤、牛奶中細菌計數(shù)。方法：用鏡臺測微尺計算出視野面積；取0.1ml菌液涂于1cm2面積上，計數(shù)后代入公式：每ml原菌液含菌數(shù)=視野中平均菌數(shù)×涂布面積/視野面積×10×稀釋倍數(shù)第13頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三3.平板菌落計數(shù)法第14頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三★技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴格無菌操作；★注意事項：每一支吸管只能用于一個稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時的培養(yǎng)基溫度；★適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物，★誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作第15頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三4。薄膜過濾計數(shù)法常用該法測定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進行培養(yǎng)，然后計算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。第16頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三5.干重法將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾分離出來,然后烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)、稱重。一般干重為濕重的10%—20%，而一個細菌細胞一般重約10-12—10-13g。該法適合菌濃度較高的樣品。舉例：大腸桿菌一個細胞一般重約10–12~10–13g，液體培養(yǎng)物中細胞濃度達到2×109個/ml時，100ml培養(yǎng)物可得10~90mg干重的細胞。第17頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三6.比濁法原理：是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。特點：快速、簡便；但易受干擾。第18頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三7.生理指標法測含氮量蛋白質(zhì)是細胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。一般細菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量再乘以6.25，就可測得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長量的測定。第19頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)微生物的生長曲線一、微生物培養(yǎng)：

研究群體生長規(guī)律，首先應(yīng)對微生物進行培養(yǎng)。培養(yǎng)的方法有：

分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)這兩種方法既可用于純種培養(yǎng)，也可用于混合

第20頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三1分批培養(yǎng)（batchculture）：分批培養(yǎng)（batchculture）：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補充和更換，最后一次性收獲第21頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三2連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時間地處于對數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。類型：恒濁連續(xù)培養(yǎng)和恒化連續(xù)培養(yǎng)第22頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三原理：當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達到對數(shù)期后期時，一方面以一定的速度流進新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達到動態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。（1）連續(xù)培養(yǎng)原理第23頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使營養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細菌生長速率恒定的方法。原理：通過控制某一種營養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長因子等），使其始終成為生長限制因子，而達到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進行生長繁殖。特點：維持營養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應(yīng)用范圍：實驗室科學(xué)研究及污水生物處理。第24頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三恒化器Chemostat或bactogen

第25頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三概念：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。原理：通過調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來維持菌濃度不變,即濁度不變。主要采用恒濁器，當(dāng)濁度高時，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。特點：基質(zhì)過量，微生物始終以最高速率進行生長，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復(fù)雜，煩瑣。恒濁連續(xù)培養(yǎng)使用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。第26頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無限制生長因子不恒定最高大量菌體或與菌體形成相平行的產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基流速（外控制）有限制生長因子恒定低于最高不同生長速率的菌體實驗室為主恒濁器與恒化器的比較第27頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三二、細菌的純培養(yǎng)生長曲線將少量細菌接種到一種新鮮的、定量的液體培養(yǎng)基中進行分批培養(yǎng)，定時取樣計數(shù)，以細菌個數(shù)或細菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標，以培養(yǎng)時間為橫坐標，連接坐標紙上各點成一條曲線即細菌的生長曲線。生長曲線可以細分為六個階段、四個時期：延遲期（停滯期）、加速期、

對數(shù)生長期、減速期、穩(wěn)定期（靜止期）、衰亡期（或死亡期）。

第28頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三典型的生長曲線

（Growthcurve）延滯期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期時期的劃分：按照生長速率常數(shù)（growthraceconstant）不同加速期減速期第29頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三其它名稱：遲滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期1.現(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平行于橫軸。2.特點生長速率=0細胞形態(tài)變大或增長細胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶對外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學(xué)藥物）3.原因：適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物①.停滯期（lagphase）第30頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三②.對數(shù)期（logarithmicphase）其他名稱：指數(shù)期現(xiàn)象：細胞數(shù)目以幾何級數(shù)增加，其對數(shù)與時間呈直線關(guān)系。

特點：生長速率最大，即代時最短菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致代謝最旺盛細胞對理化因素較敏感影響因素：菌種代謝產(chǎn)物營養(yǎng)物濃度﹡氧氣第31頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三③.靜止期（stationaryphase）又稱：穩(wěn)定期或最高生長期特點：①新增殖的細胞數(shù)與老細胞的死亡數(shù)幾乎相等，微生物的生長速率處于動態(tài)平衡，培養(yǎng)物中的活細胞數(shù)目達到最高值。②細胞分裂速度下降，開始積累內(nèi)含物，產(chǎn)芽孢的細菌開始產(chǎn)芽孢。③此時期的微生物開始合成次生代謝產(chǎn)物，對于發(fā)酵生產(chǎn)來說，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達到高峰，是最佳的收獲時期。若目標是菌體，則在靜止期初期就要及時收獲菌體。產(chǎn)生原因：

營養(yǎng)物濃度的降低有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）物化條件（pH、氧化還原勢等）的改變;溶解氧供應(yīng)不足第32頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三④.衰亡期（declinephase）特點：①細胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過新增殖的細胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)“負生長”。②細胞進行內(nèi)源性呼吸（因為營養(yǎng)缺乏），出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。③因菌體本身產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物的作用，使菌體死亡。衰亡期比其他各時期時間長，它的長短也與菌種和環(huán)境條件有關(guān)。產(chǎn)生原因：生長條件的進一步惡化，使細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡第33頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)影響微生物生長的主要因素一、溫度二、氧氣三、pH

第34頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三一、溫度對微生物生長的影響溫度是影響微生物生長的最重要因素之一。溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)在：影響酶活性。溫度變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響細胞合成。影響細胞膜的流動性。溫度高，流動性大，有利于物質(zhì)的運輸，溫度低，流動性降低，不利于物質(zhì)運輸，因此，溫度變化影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。影響物質(zhì)的溶解度。對生長有影響。第35頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三最低生長溫度:指微生物能進行繁殖的最低溫度界限。最適生長溫度：指使微生物迅速生長的溫度。最高生長溫度：指微生物生長繁殖的最高溫度界限。微生物處于最適生長溫度時，生長速度最快，代時最短。超過最低生長溫度時，微生物不生長，溫度過低，甚至?xí)劳?。超過最高生長溫度時，微生物不生長，溫度過高，甚至?xí)劳?。?6頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三根據(jù)微生物的最適生長溫度分類嗜冷微生物嗜溫微生物嗜熱微生物超嗜熱或嗜高溫微生物微生物類型最低溫度oC最適溫度oC最高溫度oC嗜冷微生物-5-05-1020-30嗜溫微生物5-1025-4045-50嗜熱微生物3050-6070-80超嗜熱或嗜高溫微生物>5570-105110-113第37頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三二、pHpH值對微生物生長的影響機制◆影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，進而影響對物質(zhì)的吸收能力?！舾淖兠富?、酶促反應(yīng)的速率及代謝途徑：如：酵母菌在pH4.5-5產(chǎn)乙醇，在pH6.5以上產(chǎn)甘油、酸?！舡h(huán)境pH值還影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收，或有毒物質(zhì)的毒性。第38頁，共41頁，2023年，2月20日，星期三一些微生物的生長酸堿度大多數(shù)細菌、藻類和原生動物的最適pH為6.5-7.5；放線菌在中性偏堿性