大豆皂苷的提取純化和測定

大豆皂苷的提取測定1、大豆簡介1．1大豆的組成成分：大豆主要成分為蛋白質35%、脂肪16%~21%、碳水化合物23%~27%、水分和粗纖維15%左右、皂苷和異黃酮等糖苷占2%左右,其中,皂苷約占0.5%。2大豆皂苷的化學組成：大豆皂苷，又稱大豆皂貳(Soyasaponins)屬于三萜類齊墩果酸型皂苷,是三萜類同系物的羥基和糖分子環(huán)狀半縮醛羥基失水縮合而成,它可以水解生成多種糖類和配糖體,目前已確認的大豆皂苷約18種，是由5種皂苷元(SoyasapogenoI、II、 III、W、V)和糖基中的0-D-半乳糖、0-D-木糖、a-L-鼠李糖、a-L-阿拉伯糖、0-D-葡萄糖醛酸等6種單糖以及乙酰基大豆皂苷(Acetyl-soyasaponin)所組成。大豆皂苷根據(jù)其苷元不同分為A類、B類、E類和DDMP類，A類皂苷是以soyasapogenolA為配基的雙糖皂苷，B類和E類是以soyasapogenolB和soyasa-pogenolE為配基的單糖皂苷，DDMP皂苷是以soyas-apogenoB作配基在C-22位上結合有2，3-dihydro-2，5-dinydroxy-6-methy-l4h-pyran-4-one的單糖鏈皂[4-5]。因為所有DDMP大豆皂苷對熱不穩(wěn)定，受熱易分解生成A類和E類皂苷，所以，有些人認為DDMP皂苷是大豆中存在的真正皂苷。由低聚糖及齊墩果烯三萜縮合形成的一類化合物,具有抗癌、調節(jié)免疫功能、防治心血管疾病、抗菌、抗病毒、護肝等多重生理功效。除用作藥物外,皂苷還可以作為高級化妝品和食品添加劑,如作為殺菌劑、抗氧化劑、發(fā)泡劑等,在化妝品和食品工業(yè)中具有廣泛的應用。大豆加工制品種類繁多，一般分為傳統(tǒng)的大豆制品和新興大豆制品。傳統(tǒng)豆制品分為非發(fā)酵制品如豆腐、干豆腐、豆腐皮、豆腐干、豆芽和發(fā)酵的豆制品如腐乳、豆豉、豆醬、醬油、天培、納豆等；新興的豆制品有大豆油脂、大豆蛋白、大豆磷脂、大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆纖維、大豆皂苷等。豆制品的生產過程中會產生大量的廢水，這些廢水含有大分子蛋白、小分子寡糖、有機酸、色素類物質和鹽類等，極易腐敗，BOD（生物需氧量）、COD（化學需氧量）值嚴重超標。另外還有很多有益的生理活性成分，如大豆異黃酮、皂苷、維生素、胰蛋白酶抑制劑等。在很多生產過程中這些廢水往往直接由下水道排放，既污染了環(huán)境，又浪費了資源。因此，從豆制品生產的廢水中提取功能性物質，無論對于環(huán)境保護還是對資源的充分利用都有著極其重要的現(xiàn)實意義。豆腐的生產流程為：加水加水大豆一清選一浸泡f磨漿一煮漿一過濾一豆?jié){一凝固一壓榨一成型一包裝黃漿水圖1豆腐生產的流程Fig.IFlowoftofuproduction大豆殘渣則是用剛榨過豆?jié){的大豆?jié)穸乖?5°C條件下干燥至恒重,過36目篩,保存制作而成。從上述生產流程可以看出，豆腐生產的廢水主要來自于浸泡大豆的廢水（泡豆水）和壓榨豆腐產生的黃漿水，另外還有部分沖洗廢水。具體成分見表1表1豆腐生產廢水Table1Wastewaterintofuproduction廢水來源質量COD(mB0D/C0D物質泡豆廢水干豆重的1-1.5倍150000.55?0.65低聚糖、檸檬酸、維生素、礦物質、色素黃漿水重的4.5-5.5倍200000.55-0.65糖類、蛋白質、脂類、氨基酸、可溶性固形物本實驗欲從大豆的廢水、壓榨豆腐產生的黃漿水和大豆殘渣中測定大豆皂苷的含量，為從大豆生產廢水中提取大豆皂苷做準備。目前三萜皂苷的提取方法主要有冷浸法、回流提取法、樹脂吸附法、凝膠吸附法、薄層層析法、超聲提取法、酶提取法、微波提取法等.通過對大孔樹脂吸附法、有機溶劑提取法、微波提取法以及超聲波提取法等四種常見提取方法進行比較,結果如下：A1、四種方法中除大孔樹脂吸附法液料比為1：10夕卜，其余三種均為1：20。A2、四種大豆皂苷提取方法提取時所需溫度分別為：大孔樹脂吸附法70°C、有機溶劑提取法80°C、微波提取法和超聲波提取法均為60°C。A3、四種大豆皂苷提取方法提取時所需時間依次為：大孔樹脂吸附法最長，為6h;其次是有機溶劑提取法為3h;再次為超聲波提取法,需25min;微波提取法最短,僅為90s。A4、四種大豆皂苷提取方法提取所得大豆皂苷吸光度依次為：微波提取法(0.310)＜超聲波提取法(0.317)＜大孔樹脂吸附法(0.479)＜有機溶劑提取法(0.489)。A5、四種大豆皂苷提取方法中大豆皂苷提取率依次為：微波提取法(59.8%)＜超聲波提取法(61.0%)＜大孔樹脂吸附法(90.2%)＜有機溶劑提取法(93.4%)。附：皂苷產率和提取率的計算式分別如下:皂昔產率(％)=皂昔實際產量/豆渣總質量X100=提取液體積X提取液濃度/豆渣總質量X100皂苷提取率=皂苷產率/皂苷理論含量通過上述四種提取方法的比較，結合實際生產條件，此次的大豆皂苷提取應采用有機溶劑沉淀法。大豆皂苷提取液中的主要雜質是可溶性糖和大豆異黃酮,可溶性糖占到提取物干重的65%以上,所以除糖是提高大豆皂苷純度的關鍵。在大豆皂苷的純化工藝中,主要依據(jù)各組分的極性及其在不同溶劑中溶解度的差異。大豆低聚糖極性相對較大,較易溶于水而不易溶于極性較小的醇中;大豆皂苷則不易溶于乙醚、乙酸乙酯、丙酮等非極性溶劑。大豆異黃酮極性一般略大于大豆皂苷的極性。因此常用以上極性的差異來分離純化大豆皂苷。目前大豆皂苷純化方法主要有以下幾種，通過對比如下：

表3大豆皂昔不同分離純化方法比較方法優(yōu)點缺點正丁醇法操作簡便溶劑消耗大、產品純度及收率均較低有機溶劑沉淀法丁藝簡單、產品純度較高溶劑耗費大酸堿水解-乙酸乙酯萃取法產品純度高只能得到昔元產品，收率低鉛鹽沉淀法產品純度極高收率低、鉛離子有毒柱層析法重復性好、成本低、產品純度高樹脂吸附容量較小柱層析-有機溶劑沉淀法產品純度高丁藝較復雜、潘劑消耗大制備色譜法大豆皇昔單體產品純度高、可作標準樣品成本高、產量低（mg級）綜合考慮，最佳分離純化方法仍是有機溶劑沉淀法，經前人各方面研究得知，丙酮為最合適的沉淀劑。因此，為有效提取具有生理活性和藥用價值的大豆皂苷,用乙醇浸提、正丁醇萃取、丙酮沉淀法提取大豆中皂苷,通過紫外光譜法檢測大豆皂苷的含量和純度。實驗方案：1.1材料與方法實驗材料：普通大豆、齊墩果酸標準樣品（市售）實驗儀器與設備：平底燒瓶數(shù)個、具塞試管數(shù)只、恒溫水浴鍋、不同量程量筒數(shù)個、紫外光分光光度計、壓榨機、恒溫干燥箱實驗試劑：70%乙醇、飽和正丁醇、80%甲醇、丙酮、5%香草醛、高氯酸、冰乙酸、乙酸乙酯（所用化學試劑均為分析純）1.2實驗步驟檢測樣品制備：取市售大豆原料1kg,采用傳統(tǒng)工藝生產豆腐,收集浸泡大豆水和黃漿水，將剛榨過豆?jié){的大豆?jié)穸乖?5°C條件下干燥至恒重獲得大豆殘渣。大豆廢水中檢測樣品的制備：大豆廢水一超濾一乙酸乙酯萃取一減壓蒸餾出去乙酸乙酯一無水乙醇溶解一上大孔樹脂層析柱一收集活性峰一減壓蒸餾除去醇和水f大豆異黃酮混合物（以上出自豆丁網的《豆腐生產中黃漿水的綜合利用》）由于大豆皂甙與大豆異黃酮溶解度和含量基本相似,所以也可以從大豆乳清廢水中提取大豆皂甙。利用提取異黃酮的實驗方法將二者的混合物提取出后,利用有機溶劑法提取大豆皂苷（同大豆殘渣）。大豆殘渣中粗皂苷樣品的制備：取大豆殘渣50g兩份分別置于2個500ml的平底燒瓶中；向其中加入70%乙醇溶液350ml搖勻；在80C恒溫下浸泡7h；冷卻后用布氏漏斗過濾，將濾液濃縮到50ml；用等體積飽和正丁醇萃取,取正丁醇相濃縮至呈褐色粘稠狀冷卻；加入2.8ml的80%甲醇溶液溶解；再加入40mL丙酮充分振蕩,離心沉淀,烘干稱重即得粗皂苷。大豆皂苷含量的測定方法采用香草醛－高氯酸比色法對大豆皂苷的含量進行檢測，通過分析幾種顯色反應方法，確立了最佳顯色條件：向樣品中分別加入0.2ml5%香草醛溶液和0.8ml高氯酸，于70°C水浴反應15min,流水冷卻，加入5ml冰乙酸。1.2A標準曲線的制作稱取齊墩果酸標準品27.60mg置于100mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為0.276ug/uL的標準溶液，吸取齊墩果酸標準溶液100、200、300、400、500、600uL于具塞試管中,70C水浴上蒸干，于每個試管中加新配制的質量分數(shù)5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,置60C水浴上加熱15min,流水冷卻，加冰醋酸5mL，搖勻，以550nm為設定波長測定吸光值。以吸光值為縱坐標(Y),齊墩果酸相當量為橫坐標(X,Ag),