典型生長(zhǎng)曲線

微生物的生長(zhǎng)第三節(jié)微生物的群體生長(zhǎng)一、單細(xì)胞微生物的典型生長(zhǎng)曲線將少量單細(xì)胞微生物接種到新鮮液體培養(yǎng)基中，在最適的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，以細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，畫(huà)出的曲線，就是單細(xì)胞微生物的典型生長(zhǎng)曲線。典型生長(zhǎng)曲線根據(jù)微生物的生長(zhǎng)速率常數(shù)R（即每小時(shí)的分裂次數(shù)）的不同，一般可分為遲緩期（延滯期）、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等四個(gè)時(shí)期。1.延滯期（Lagphase），也稱遲緩期、延遲期、適應(yīng)期。菌數(shù)不立即增加,或增加很少；生長(zhǎng)速度接近于零。此時(shí)細(xì)胞特點(diǎn)可概括為：分裂遲緩、代謝活躍。該期的具體特點(diǎn)為：①生長(zhǎng)速率常數(shù)為零；②細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng)；③細(xì)胞內(nèi)的RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性；④合成代謝十分活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加速，容易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶；⑤對(duì)外界條件如NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等理化因素反應(yīng)敏感。遲滯期出現(xiàn)的原因：微生物接種到一個(gè)新的環(huán)境，暫時(shí)缺乏分解和催化有關(guān)底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。調(diào)整代謝遲滯期的長(zhǎng)短與菌種的遺傳性、菌齡以及移種前后所處的環(huán)境條件等因素有關(guān)，短的只需要幾分鐘，長(zhǎng)的需數(shù)小時(shí)?？s短遲滯期的常用手段：(1)通過(guò)遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期縮短；(2)利用對(duì)數(shù)期的細(xì)胞作為種子；(3)盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；(4)適當(dāng)擴(kuò)大接種量。2.指數(shù)期（Exponentialphase），又稱對(duì)數(shù)期（Logphase)生長(zhǎng)速度呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。指數(shù)期的特點(diǎn)：①生長(zhǎng)速率常數(shù)R最大且為常數(shù)，代時(shí)(G)最短且穩(wěn)定；②細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，菌體各部分的成分十分均勻；③酶系活躍，代謝旺盛。三個(gè)重要參數(shù)的計(jì)算：繁殖代數(shù)(n)、生長(zhǎng)速率常數(shù)(R)、代時(shí)(G)

t1

–t01G=——————=—————

nR注意：只有處于指數(shù)期，才符合以上計(jì)算公式采用木醋桿菌生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，培養(yǎng)的第5h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)活菌數(shù)是1×105個(gè)/ml，總菌數(shù)是1.1×105個(gè)/ml,培養(yǎng)的第10個(gè)小時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)活菌數(shù)是1×107個(gè)/ml，總菌數(shù)是1.2×107個(gè)/ml，請(qǐng)計(jì)算代數(shù)（n)和代時(shí)（G）影響代時(shí)的因素：1）菌種：不同的微生物及微生物的不同菌株代時(shí)不同；2）營(yíng)養(yǎng)成分：在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)代時(shí)短；3）營(yíng)養(yǎng)物濃度：在一定范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速率與營(yíng)養(yǎng)物濃度呈正比；凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長(zhǎng)速率的營(yíng)養(yǎng)物成分，就稱為生長(zhǎng)限制因子。4）溫度：在一定范圍，生長(zhǎng)速率與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)。指數(shù)期細(xì)胞的應(yīng)用：適宜作“種子”；研究基礎(chǔ)代謝的材料；噬菌體增殖的最好階段；革蘭氏染色；誘變育種。3.穩(wěn)定期（Stationaryphase）指數(shù)期之后，培養(yǎng)液中活細(xì)菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定的階段(可能由于細(xì)菌分裂增加的數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù)，或者細(xì)胞僅停止分裂而保持代謝活性)。穩(wěn)定期特點(diǎn)：①生長(zhǎng)速率常數(shù)R降低至0；②代時(shí)G延長(zhǎng)；③細(xì)胞重要的分化階段；細(xì)胞開(kāi)始衰老，原生質(zhì)分布不均勻，出現(xiàn)液泡；開(kāi)始積累糖原等內(nèi)含物；產(chǎn)芽孢的菌開(kāi)始形成芽孢；次生代謝產(chǎn)物（抗生素等）開(kāi)始大量合成④菌體的最大收獲期穩(wěn)定期到來(lái)的原因①營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡②有害代謝產(chǎn)物的累積③營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)④pH、氧化還原勢(shì)等條件不適宜①穩(wěn)定期如果及時(shí)采取措施，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件（調(diào)整pH、溫度、通氣），可以獲得更多的菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物。②對(duì)以收獲菌體或與菌體生長(zhǎng)相平行的代謝產(chǎn)物（SCP、乳酸等）為目的的發(fā)酵生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期。③通過(guò)對(duì)穩(wěn)定期到來(lái)原因的研究，促使了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝、技術(shù)的創(chuàng)建。微生物在穩(wěn)定期的生長(zhǎng)規(guī)律對(duì)于生產(chǎn)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：4.衰亡期（Decline或Deathphase）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細(xì)菌死亡速率超過(guò)新生速率，整個(gè)群體呈現(xiàn)出負(fù)增長(zhǎng)。該時(shí)期死亡的細(xì)菌以對(duì)數(shù)方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會(huì)使細(xì)菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。衰亡期特點(diǎn)：①生長(zhǎng)速率常數(shù)R小于0；②細(xì)胞形態(tài)發(fā)生多形化

出現(xiàn)畸形或細(xì)胞大小懸殊；有些微生物因蛋白酶活力的增強(qiáng)而發(fā)生自溶，有些微生物產(chǎn)生或釋放出一些代謝產(chǎn)物如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等；芽孢桿菌往往在此期釋放芽孢。

在實(shí)際工作中多采用分光光度計(jì)測(cè)定OD值的方法繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，但該法繪制的生長(zhǎng)曲線不能反映衰亡期。二.絲狀真菌的生長(zhǎng)曲線絲狀真菌是以菌絲干重（mg）作為衡量生長(zhǎng)狀況的縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。三個(gè)時(shí)期：延滯期，快速生長(zhǎng)期，衰亡期絲狀真菌不是單細(xì)胞，其繁殖不以幾何級(jí)數(shù)增加，故沒(méi)有指數(shù)生長(zhǎng)期1、典型生長(zhǎng)曲線也適于描述絲狀菌的生長(zhǎng)規(guī)律（）2、一般來(lái)說(shuō)，用指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作為“種子”（）3、對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)，可以用直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法來(lái)測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)量（）4、對(duì)霉菌來(lái)說(shuō)，可以采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法來(lái)測(cè)定其生長(zhǎng)量（)三、連續(xù)培養(yǎng)(Continousculture）分批培養(yǎng)（batchculture）封閉培養(yǎng)（closedculture）培養(yǎng)基一次加入，不予補(bǔ)充，不再更換連續(xù)培養(yǎng)(Continousculture）培養(yǎng)基連續(xù)加入，發(fā)酵液以相同的流速連續(xù)流出，從而達(dá)到穩(wěn)態(tài)平衡。若在一個(gè)開(kāi)放的系統(tǒng)中(恒定容積的流動(dòng)系統(tǒng))培養(yǎng)微生物，培養(yǎng)過(guò)程中不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物，是實(shí)現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞數(shù)量和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)恒定，即處于穩(wěn)態(tài)。單細(xì)胞微生物的生長(zhǎng)符合典型的生長(zhǎng)曲線最簡(jiǎn)單的連續(xù)培養(yǎng)裝置包括：培養(yǎng)室、無(wú)菌培養(yǎng)基儲(chǔ)存器和調(diào)節(jié)流速的控制系統(tǒng)。連續(xù)培養(yǎng)的主要參數(shù)稀釋率D（h-1）：即培養(yǎng)基每小時(shí)流過(guò)培養(yǎng)容器的體積數(shù)。D==培養(yǎng)基的流動(dòng)速率培養(yǎng)室的容積FV無(wú)菌培養(yǎng)基儲(chǔ)存器培養(yǎng)室調(diào)節(jié)流速的控制閥1.連續(xù)培養(yǎng)的類型根據(jù)控制培養(yǎng)基流入培養(yǎng)容器方式的不同可分兩種類型：恒濁器連續(xù)培養(yǎng)和恒化器連續(xù)培養(yǎng)。A.恒濁培養(yǎng)系統(tǒng)B.恒化培養(yǎng)系統(tǒng)1.盛無(wú)菌培養(yǎng)基的容器2.控制流速閥3.培養(yǎng)室4.排出管5.光源6.光電池7.排出物恒濁器：根據(jù)培養(yǎng)室內(nèi)微生物的生長(zhǎng)密度，借光電控制系統(tǒng)來(lái)控制培養(yǎng)基的流速，以取得菌體密度高、生長(zhǎng)速率恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)器。恒化器：培養(yǎng)基流速恒定，通過(guò)控制培養(yǎng)基中某一生長(zhǎng)限制性底物的濃度來(lái)調(diào)節(jié)微生物的生長(zhǎng)速率,使微生物維持恒定生長(zhǎng)速率的連續(xù)培養(yǎng)裝置。兩種連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的比較裝置控制對(duì)象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長(zhǎng)速率產(chǎn)物應(yīng)用恒濁器菌體密度無(wú)限制生長(zhǎng)因子不恒定最高菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)恒化器培養(yǎng)基流速有限制生長(zhǎng)因子恒定低于最高速率不同生長(zhǎng)速率的菌體實(shí)驗(yàn)室科研恒化器中的菌體濃度不由稀釋率決定，而由生長(zhǎng)限制性底物濃度決定。通過(guò)控制流速可得到生長(zhǎng)速率不同但密度基本恒定的培養(yǎng)物，微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。遺傳學(xué)：突變株分離；生理學(xué)：不同條件下的代謝變化；生態(tài)學(xué)：模擬自然營(yíng)養(yǎng)條件建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿绻鶕?jù)連續(xù)培養(yǎng)器串聯(lián)的數(shù)目分，也可分為兩種類型：?jiǎn)渭?jí)連續(xù)培養(yǎng)多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)適用于：代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生速率與菌體生長(zhǎng)速率相平行的培養(yǎng)微生物代謝產(chǎn)物與菌體生長(zhǎng)不平行，例如丙酮、丁醇或某些次級(jí)代謝產(chǎn)物（抗生素、維生素等）的生產(chǎn)，應(yīng)采取多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)法，第一級(jí)發(fā)酵罐中