人類細(xì)胞質(zhì)的提取

關(guān)于人類細(xì)胞質(zhì)的提取第1頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取第2頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

真核細(xì)胞質(zhì)總RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。第3頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物第4頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RNA的不穩(wěn)定性

由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解

RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活。所以需要RNA酶抑制劑來(lái)抑制RNA酶的活性。第5頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、分離高質(zhì)量RNA

RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值。（1）常用的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。第6頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。第7頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（2）RNA提取的一般步驟RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA第8頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織

加入β-ME可以抑制RNA酶活性分離RNA一半用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過(guò)此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開(kāi)。沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或異丙醇。第9頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月④洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過(guò)于干燥，否則不易溶解。⑤融解RNA一般使用TE。⑥保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對(duì)于長(zhǎng)期貯存也應(yīng)該如此。第10頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

由于RNA的種類來(lái)源很多，因而提取制備方法各異。本次介紹的是Trizol法制備RNA。第11頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Trizol法提取RNA

TRIzol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性，因此對(duì)純化RNA及標(biāo)準(zhǔn)化RNA的生產(chǎn)十分有用。第12頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

Trizol試劑主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。

苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。

Trizol試劑裂解細(xì)胞并釋放出RNA,酸性條件使RNA與DNA分離,加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過(guò)異丙醇以沉淀的方式還原。在除去水樣層后，乙醇能沉淀析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。第13頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月【試劑】

DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿，異丙醇，無(wú)水乙醇，0.05～0.1％DEPC－H2O，75％乙醇，TE緩沖液，瓊脂糖?！九渲啤?.DEPC水：1ml＋1000ml雙蒸水＝1‰DEPC水，1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)。2.75%乙醇：無(wú)水乙醇+DEPC水，-20℃保存（DEPC水需先高壓）[實(shí)驗(yàn)用品]第14頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基本過(guò)程

一、抽提

二、分相

三、RNA沉淀

四、RNA清洗第15頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、抽提細(xì)胞抽提1.組織取材后用滅菌的錫箔紙包好保存于液氮。實(shí)驗(yàn)時(shí)，在液氮中將組織研磨成粉末，趁液氮未揮發(fā)將粉末轉(zhuǎn)移到EP管，室溫5000rpm離心去上清。每50-100mg組織，加入1mlTrizol，反復(fù)抽吸均勻。第16頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、分相3.在裝有裂解物的離心管中加入0.2ml的氯仿(為T(mén)rizol總體積的1/5),振蕩

混勻30秒，室溫下靜置5分鐘.4.12000rpm離心15分鐘4°C,分相為三層。上層：RNA(約為T(mén)rizol的

60%)；中間：DNA；下層:蛋白質(zhì)(酚-氯仿)。5.小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到另一EP管中。1ml裂解物產(chǎn)生的上清液體積

約為0.4～0.6ml。有機(jī)相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì),避免觸及。三、RNA沉淀6.上清液加入約0.5ml的異丙醇,振蕩30秒混勻。室溫下靜置10分鐘。7.4°C，離心12000rpm10分鐘。8.RNA沉淀將在離心底的側(cè)面形成。小心吸棄上清液,注意避免吸棄RNA

沉淀。第17頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、RNA清洗9.離心管加入1ml預(yù)冷的75%乙醇(1mlTrizol至少用1ml乙醇清洗DNA),振蕩混勻30秒，使沉淀振蕩起來(lái)，室溫離心12000rpm×1～2分鐘。盡可能吸棄上清液,防止RNA沉淀丟失。重復(fù)以上清洗步驟一次。在75%乙醇中，RNA在4℃至少可以保存1周，－20℃至少可以保存1年。10.室溫選擇流動(dòng)性小，倒置離心管于濾紙上，干燥RNA，但不能完全干燥(5～10分鐘)。用DEPC水15μl溶解沉淀，55-60℃孵育10～15分鐘。11.測(cè)量OD值后，樣品放置－70℃保存，一個(gè)月第18頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RT-PCR第19頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。應(yīng)用RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。第20頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月oligo:多聚體，相當(dāng)于mRNA引物AMVRT：禽類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶MMLVRT：莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs：脫氧核苷酸RNase：RNA水解酶PCRBuffer：RT-PCR緩沖液MgCl2：2價(jià)鎂離子第21頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基本過(guò)程

由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶即逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)完成。

隨后，DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。

原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補(bǔ)DNA。第22頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即鳥(niǎo)類成髓細(xì)胞性白細(xì)胞病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）反轉(zhuǎn)錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus,MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶。第23頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第24頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳第25頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

瓊脂糖凝膠電泳主要是應(yīng)用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，核酸片段因其分子量或者分子形狀的不同，電泳速度有差異而分離，這種技術(shù)是基因操作中常用的一種方法。

與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。第26頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳檢測(cè)在基因組DNA的提取中，用蒸餾水溶解提取出的DNA，在1.0%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳，以Marker(