動物布病診斷技術

關于動物布病診斷技術第1頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月布魯氏菌病檢驗方法：依據(jù)標準：GB/T18646-2002

適用范圍本標準規(guī)定了動物布魯氏菌病的診斷技術。本規(guī)定的虎紅平板凝集試驗、乳牛全乳環(huán)狀試驗適用于家畜布病田間篩選試驗和乳牛場布病的監(jiān)測及診斷泌乳母牛布病的初篩試驗；試管凝集試驗和補體結合試驗適用于診斷羊種、牛種和豬種布病感染的家畜。本標準規(guī)定的試管凝集試驗不適用于犬種和綿羊副睪種布病感染家畜的檢疫。第2頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月虎紅平板凝集試驗第3頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月材料準備抗原、標準陽性血清、陰性血清由指標單位提供，按說明用。受檢血清應新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血和無腐敗氣味。準備一塊潔凈玻璃板，畫成若干個4厘米小格或虎紅平板凝集試驗卡片。吸管或移液器，適于滴加0.03ml（即300μl）液體。牙簽或火柴桿供攪拌用。第4頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月第5頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月操作方法

將玻璃板上各格標記受檢血清號(或在布病反映卡上操作)，然后加相應血清0.03ml。圖1.在受檢血清旁滴加抗原0.03ml。用牙簽類小棒攪動血清和抗原使之混合。圖2每次試驗應設陰性、陽性血清對照圖1圖2第6頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月結果判定

判定結果前最好將抗原與血清混合物搖動幾下.如圖3.在陰性、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判定。被檢血清在4分鐘內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象者判為陽性（+），無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（—）。圖4.圖5每份被檢血清在規(guī)定時間內(nèi)出現(xiàn)凝集反應者判為陽性，不出現(xiàn)凝集為陰性反應。圖3第7頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月陽性陰性圖4第8頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月陰性陽性圖5第9頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項：

本抗原適合于大數(shù)量田間檢疫和篩選診斷試驗用。本試驗出現(xiàn)陽性反應的動物，需經(jīng)補體結合試驗或其它輔助試驗方可定性。本抗原使用前應充分搖勻，方可使用。凡本抗原出現(xiàn)污染或搖不散的凝集塊者不得使用。第10頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月布魯氏菌病乳環(huán)試管凝集試驗

第11頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月布病全乳環(huán)狀抗原，由指標單位提供，按說明用。

乳樣受檢乳樣須為新鮮全乳。采乳樣時應將母畜的乳房用溫水洗凈、擦干，然后將乳液擠入潔凈的器皿中。采集的乳樣夏季時應于當日內(nèi)檢查；保存于2℃時，7d內(nèi)仍可適用。需要器具有：水浴鍋、100μl移液器、1000μl移液器、小試管、試管架、移液器槍頭、乳環(huán)抗原等。材料準備：第12頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月操作方法

取乳樣1ml，加于滅菌凝集試驗管內(nèi)。取充分震蕩混合均勻的全乳環(huán)狀抗原1滴（約50μl）加入乳樣中充分混勻。置37℃～38℃水浴中60min。加熱后取出試管勿使震蕩，立即進行判定。第14頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月結果判定

強陽性反應（+++），乳柱上層乳脂形成明顯紅色環(huán)帶，乳柱白色，臨界分明；陽性反應（++），乳脂層的環(huán)帶呈紅色，但不顯著，乳柱略帶顏色；弱陽性反映（+）乳脂層的環(huán)帶顏色較淺，但比乳柱上顏色略深；疑似反映（±）乳脂層的環(huán)帶顏色不明顯，于乳柱分界不清，乳柱不褪色；陰性反映（—）乳柱上層無任何變化，乳柱顏色均勻。第15頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月乳環(huán)試驗陽性第16頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月乳環(huán)試驗陽性第17頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月乳環(huán)試驗陰性，乳汁顏色均勻，未見紅色乳環(huán)第18頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月布魯氏菌病試管凝集試驗

第19頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月材料準備

稀釋液：0.5%石碳酸生理鹽水。檢驗羊血清時用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，如果血清稀釋用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋亦用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液。1.2抗原、陽性血清、陰性血清由指標單位提供，按說明書使用。1.3凝集試驗管（三分管）、試管架、吸管及溫箱等。3分是英制管道直徑長度的叫法，換算成毫米為9.525mm，這里指內(nèi)徑約為10mm試管第20頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月操作方法1.按常規(guī)方法采血分離血清。2.運送和保存血清樣品時防止凍結和受熱，以免影響凝集價。若3d內(nèi)不能送檢，按每9ml血清加1ml5%石碳酸生理鹽水防腐，也可冷藏方法運送血清。3.被檢血清的稀釋以羊和豬為例，每份血清用4支凝集試管。3.1第1管標記檢驗編碼后加1.15mL稀釋液。3.2第2～4管各加入0.5mL稀釋液。3.3然后向第1管內(nèi)加入0.1mL被檢血清，并混合均勻。充分混勻后棄去混合液0.25mL。第21頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月3.4取0.5ml混合液加入第2管，混合均勻。3.5再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去混勻液0.5mL。3.6稀釋完畢，從第1至第4管的血清稀釋度分別為1:12.5、1:25、1:50和1:100。3.7牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋法與上述基本一致，差異是第1管加1.2mL稀釋液和0.05mL被檢血清。第22頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月3.8將0.5mL稀釋好（具體稀釋倍數(shù)參照試劑生產(chǎn)廠家的要求，一般是1：10）的抗原加入已稀釋好的各血清管中，并振搖均勻，羊和豬的血清稀釋則依次變?yōu)?:25、1:50、1:100和1:200，牛、馬和駱駝的血清稀釋度則依次變?yōu)?:50、1:100、1:200和1:400。大規(guī)模檢疫時也可只用2個稀釋度，即牛、馬、鹿、駱駝用1：50和1：100，豬、山羊、綿羊和狗用1:25和1:50。第23頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月布魯氏菌病試管凝集反應試驗（羊、豬）

1號管2

號管

3號管

4號管....................

n0.5%石炭酸10%鹽水1.150.50.50.5....................最后一管棄去0.5ml

被檢血清或陽陰性血清對照加0.1ml血清，混勻后棄去0.25ml最后體積為1ml0.50.50.5....................試管中加抗原以前液體量0.50.50.50.50.50.5加抗原液（1：10稀釋好的）

0.50.50.50.50.50.5血清稀釋度1:251:501:1001:200....................充分混勻37℃18-24小時溫育

結果判定

++++++++++--吸0.5ml第24頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月布魯氏菌病試管凝集反應試驗（牛）

12

3

4....................

n0.5%石炭酸鹽水1.20.50.50.5....................最后一管棄去0.5ml

被檢血清或陽陰性血清對照加0.05ml血清，混勻后棄去0.25ml最后體積為1ml0.50.50.5....................試管中加抗原以前液體量0.50.50.50.50.50.5加抗原液（1：10稀釋好的）

0.50.50.50.50.50.5血清稀釋度1:501:1001:2001:400....................充分混勻37℃18-24小時溫育

結果判定

++++++++++--吸0.5ml第25頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月3.9每次試驗均應設陽性血清、陰性血清和抗原對照，a)陰性血清對照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與被檢血清相同。b)陽性血清對照：陽性血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與被檢血清相同。c)抗原對照：稀釋好的抗原液0.5ml,再加0.5ml稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。3.10將稀釋好各管置37℃～40℃溫箱24小時，取出檢查并記錄結果。第26頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月結果判定

1供判定參照比濁管制備方法略2結果判定2.1凝集成度分為：參照比濁管，按各試管上層液體清亮度判讀⑴＋＋＋＋菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮；⑵＋＋＋菌體幾乎完全凝集，上層液體75%清亮；⑶＋＋菌體凝集顯著，液體50%清亮；⑷＋凝集物有沉淀，液體25%清亮；⑸－凝集物無沉淀，液體均勻混濁。第27頁，課件共33頁，創(chuàng)作于2023年2月2.2牛、馬、鹿、駱駝1：100血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗1：50血清稀釋，出現(xiàn)“＋＋”以上凝集現(xiàn)象時，被檢血清判定為陽性。2.3牛、馬、鹿、駱駝1：50血清稀釋，豬、山羊、綿羊、狗1：25血清稀釋，出現(xiàn)“＋＋”以上凝集現(xiàn)象時，被檢血清判定為可疑反應?？梢煞磻倚蠼?jīng)3～4周后重檢，如果仍為可疑，該牛、羊判為陽性。豬和馬經(jīng)重檢仍保持可疑水平，而農(nóng)場的牲畜沒有臨床癥狀和大批陽性患畜出現(xiàn)，該畜被判為陰性。第28頁，課件共33