細(xì)胞破碎-“黃岡杯”一等獎(jiǎng)

細(xì)胞破碎1細(xì)胞破碎就是采用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中。概念細(xì)胞破碎機(jī)理圖微生物革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)(6-8%）脂類(lèi)(8.5-13.5%)多聚糖（80-90%）脂類(lèi)蛋白質(zhì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)細(xì)胞破碎的阻力細(xì)菌破碎的主要阻力來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)成熟的植物細(xì)胞壁分為初生壁和次生壁細(xì)胞的破影響因素物理破碎時(shí)影響因素：細(xì)胞的大小形狀細(xì)胞壁的厚度聚合物的交聯(lián)程度酶法和化學(xué)法溶解細(xì)胞影響因素：組成結(jié)構(gòu)細(xì)胞破碎方法（按是否使用外加作用力）分類(lèi)作用機(jī)理適應(yīng)性機(jī)械法珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽(yáng)性菌超聲破碎法液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合非機(jī)械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活分類(lèi)作用機(jī)理適應(yīng)性物理破碎高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽(yáng)性菌珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難超聲破碎法液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用反復(fù)凍融法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜的滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合化學(xué)破碎酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差細(xì)胞破碎的方法（按細(xì)胞所受作用）

高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）——大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法原理：細(xì)胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。高壓勻漿器不宜采用高壓勻漿法的微生物：

易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽(yáng)性菌，含有包含體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）適用于：微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模破碎。

臥式撞擊破碎原理：細(xì)胞冷凍后成為剛性球體，再進(jìn)行高速撞擊而破碎特點(diǎn)：細(xì)胞破碎均勻；可通過(guò)調(diào)節(jié)載氣壓力控制細(xì)胞破碎程度；適用于細(xì)胞器（如線粒體、葉綠體）的回收。其原理可能與空穴現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。

超聲破碎法（Ultrasonication）超生波破碎細(xì)胞時(shí)的頻率一般為15～20kHz，功率為100～250W，可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)式兩種型式。將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。反復(fù)凍融法缺點(diǎn)：適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過(guò)程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。（6）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥酶溶法化學(xué)試劑破碎法外加酶法自溶法表面活性物質(zhì)EDTA螯合劑有機(jī)溶劑變性劑2.化學(xué)破碎（Chemicalpermeation）（1）酶溶法（EnzymaticLysis）①外加酶法常用的溶酶G+

溶菌酶、適量抑制劑G-

溶菌酶、EDTA放線菌溶菌酶酵母菌β-葡聚糖酶霉菌幾丁質(zhì)酶、植物纖維素酶、半纖維素酶細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。（2）化學(xué)試劑破碎法（Chemicalpermeation）該法取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。

用堿處理細(xì)胞，可以溶解除去細(xì)胞壁以外的大部分組分。酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成游離的氨基酸。能溶解細(xì)胞壁中的磷脂層，使細(xì)胞破壞。有機(jī)溶劑變性劑鹽酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲（Urea）是常用的變性劑。常用的有機(jī)溶劑：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高級(jí)醇等。變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。通用性差