基因診斷新版專題知識

基因診斷新版專題知識基因診斷新版專題知識第1頁疾病根本原因:

疾病各種表型改變是基因改變造成基因診斷新版專題知識第2頁基因診療:

采取分子生物學(xué)技術(shù)方法來分析受檢者某一特定基因結(jié)構(gòu)(DNA水平)或功效(RNA水平)是否異常，以此來對對應(yīng)疾病進(jìn)行診療。是病因診療。

檢驗基因存在、缺點(diǎn)或表示異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診療方法和過程。基因診療(GeneDiagnosis)含義基因診斷新版專題知識第3頁基因診療原理1、基因診療原理：DNA診療----檢測相關(guān)基因結(jié)構(gòu)及其表示功效是否正常。RNA診療----對表示產(chǎn)物mRNA質(zhì)和量表達(dá)分析?；蛟\斷新版專題知識第4頁第一節(jié)基因診療技術(shù)方法基因診斷新版專題知識第5頁一、基因診療中常見分子生物學(xué)技術(shù)㈠核酸分子雜交㈡PCR㈢SSCP（PCR-SSCP）㈣限制酶酶譜分析㈤DNA序列測定㈥DNA芯片技術(shù)基因診斷新版專題知識第6頁

核酸分子雜交：按照堿基互補(bǔ)配對標(biāo)準(zhǔn)，將不一樣起源序列互補(bǔ)單鏈DNA/DNA，RNA/RNA，互補(bǔ)配對成雙鏈雜交分子，這一過程叫核酸分子雜交?；蛟\斷新版專題知識第7頁

一、原位分子雜交技術(shù)

DNA變性:

當(dāng)溶液中DNA分子處于高溫或高pH值(13)條件下,

維持雙螺旋在一起堿基互補(bǔ)對就被破壞,DNA雙鏈解離成兩條單鏈,這一過程叫DNA變性。

DNA復(fù)性:

當(dāng)溫度降低至適當(dāng)溫度或恢復(fù)pH值至中性，兩條裂解單鏈按堿基互補(bǔ)配對標(biāo)準(zhǔn)重新形成雙鏈結(jié)構(gòu),這一過程叫DNA復(fù)性,又叫DNA雜交。基因診斷新版專題知識第8頁基因診斷新版專題知識第9頁

原位雜交：用核苷酸探針對特殊核苷酸次序在其原位進(jìn)行

(insituhybridization)雜交,叫原位雜交?？捎糜贒NA、RNA定位研究。基因診斷新版專題知識第10頁熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）基因診斷新版專題知識第11頁印跡技術(shù)類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體分析。(不但能夠檢出特異DNA片段，而且能進(jìn)行定位和測定分子量，可用于基因酶切圖譜分析、基因突變分析等)（二）RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

用于RNA定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。

基因診斷新版專題知識第12頁Southern印跡雜交用于基因探測基礎(chǔ)過程

Southern印跡雜交常見于探測DNA限制性內(nèi)切酶圖譜。經(jīng)過檢測某個體特定基因及旁側(cè)區(qū)域限制性內(nèi)切酶圖譜改變，可判斷是否發(fā)生了顯著DNA突變。詳細(xì)方法圖示以下：基因診斷新版專題知識第13頁組織或細(xì)胞

含已知基因重組質(zhì)粒菌株

基因組DNA

質(zhì)粒DNA

限制酶酶解及電泳分離限制酶酶解及電泳分離回收含已知基因DNA片段

轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜標(biāo)識探針

預(yù)雜交雜交洗膜放射自顯影

圖用Southern印跡雜交方法進(jìn)行基因診療基礎(chǔ)步驟

基因診斷新版專題知識第14頁三種印跡技術(shù)比較基因診斷新版專題知識第15頁分子雜交試驗①②③目錄基因診斷新版專題知識第16頁放射自顯影照片目錄基因診斷新版專題知識第17頁核酸分子雜交制備樣品制備探針雜交檢測取得滿意高特異性雜交關(guān)鍵是控制好雜交條件和雜交后沖洗條件基因診斷新版專題知識第18頁基因診斷新版專題知識第19頁取得滿意高特異性雜交關(guān)鍵是控制好雜交條件和雜交后沖洗條件。雜交雙鏈穩(wěn)定程度主要由其Tm值（熔解溫度）決定。影響雜交雙鏈Tm值原因包含以下幾個方面：

1)雜交雙鏈堿基組成。GC含量越高，Tm越高。2)雜交雙鏈長度。越長，Tm越高。3)雜交雙鏈堿基錯配程度。錯配程度越低，Tm越高。4)溶液中離子強(qiáng)度。離子強(qiáng)度越高，Tm越高。5)變性劑（如常見甲酰胺）影響。甲酰胺濃度越高，Tm越高?；蛟\斷新版專題知識第20頁在液相體系中，完全配正確核酸雙鏈Tm值能夠以下公式預(yù)計：

DNA/DNATm(0C)＝81.5+0.41×(G-C)%+16.6×logM－0.63×甲酰胺(%)－600/LDNA/RNATm(0C)＝79.8+0.58×(G-C)%+18.5×logM+11.8[(G-C)%]2－0.50×甲酰胺(%)－820/LRNA/RNATm(0C)＝79.8+0.58×(G-C)%+18.5×logM+11.8[(G-C)%]2－0.35×甲酰胺(%)－820/L基因診斷新版專題知識第21頁寡聚核苷酸Tm(0C)＝2（AT堿基對數(shù)）＋4（GC堿基對數(shù)）（適合用于10～30bp）Tm(0C)＝81.5+0.41×(G-C)%+16.6×logM－600/L（適合用于14～70bp）

其中M為單價陽離子（通常為Na+）濃度,L為雜交雙鏈長度，以堿基對計算。這些公式適合用于0.01~0.4mol/LNa+濃度及30－75GC％。

在無變性劑存在條件下，最適雜交發(fā)生在比DNA/DNATm低20－250C，比DNA/RNATm低10－150C。在固液體系中，雜交條件對雜交雙鏈Tm值影響更為復(fù)雜，普通低于按上述公式得到計算值?；蛟\斷新版專題知識第22頁(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（PCRpolymerasechainreaction)

又叫體外基因擴(kuò)增技術(shù)。利用人工合成一對引物，在被擴(kuò)增DNA模板鏈兩端形成雙鏈，由DNA聚合酶催化一對引物之間聚合反應(yīng)。基因診斷新版專題知識第23頁

詳細(xì)過程：①變性：將雙鏈DNA加熱（95℃）使之變性，DNA雙鏈變成單鏈②退火：降低溫度至56℃使引物與模板DNA單鏈結(jié)合③延伸：將溫度升至72℃，在DNA聚合酶作用下，在引物3’端進(jìn)行延伸，使原模板DNA一條鏈變成兩條鏈?；蛟\斷新版專題知識第24頁5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555（1）、基礎(chǔ)工作原理目錄基因診斷新版專題知識第25頁Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA含量能夠擴(kuò)充100萬倍以上。目錄基因診斷新版專題知識第26頁模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

（2）、PCR體系基礎(chǔ)組成成份基因診斷新版專題知識第27頁（3）、PCR基礎(chǔ)反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C基因診斷新版專題知識第28頁（三）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析

PCR和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandedconformationpolymorphism,SSCP)分析

把PCR后取得雙股DNA加熱變性后形成單鏈DNA，相同長度DNA單鏈因為堿基次序不一樣，它們在中性聚丙烯酰胺凝膠中可有不一樣構(gòu)象而造成電泳速度不一樣，這種現(xiàn)象稱為單鏈構(gòu)象多態(tài)性。

PCR產(chǎn)物變性后經(jīng)由SSCP分析，可能有效檢出DNA次序變異。不是全部核苷酸序列改變都引發(fā)可檢測單鏈構(gòu)象改變，所以SSCP方法并不能判別全部突變。基因診斷新版專題知識第29頁P(yáng)CR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異基因遷移位置不一樣，可分析確定致病基因存在。

基因診斷新版專題知識第30頁基因診斷新版專題知識第31頁四、限制酶酶譜分析基因突變造成酶切位點(diǎn)丟失或相對位置發(fā)生改變

以此酶消化待測DNA和野生型對照DNA，經(jīng)過比較二者酶切片段，長度，數(shù)量上差異就可判斷待測DNA突變情況?；蛟\斷新版專題知識第32頁㈤DNA序列測定

是進(jìn)行基因突變檢測最直接、最準(zhǔn)確方法。不但可確定突變部位，而且可確定突變性質(zhì)。分子克隆到T載體上，或直接對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

基因診斷新版專題知識第33頁DNA芯片(DNAchip)

cDNA芯片(cDNAchip)是指將許多特定DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積支持物上

。（六）DNA芯片技術(shù)基因芯片(genechip)基因診斷新版專題知識第34頁目錄基因診斷新版專題知識第35頁二、基因診療基礎(chǔ)方法基因變異致病類型：內(nèi)源基因變異基因結(jié)構(gòu)突變點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、異位、基因擴(kuò)增，基因表示異常mRNA剪接異常外源基因插入基因診斷新版專題知識第36頁㈠基因突變診療點(diǎn)突變診療①診療已知點(diǎn)突變（PCR/ASO）

ASOallelespecificoligonucleotide等位基因特異性寡核苷酸探針突變堿基置探針中央控制雜交條件結(jié)果分析：基因診斷新版專題知識第37頁ATCG

探針定位正常CT(純合子)

CTCGCA(雜合子)（新突變）（新突變）基因診斷新版專題知識第38頁②診療未知突變PCR/SSCP/測序DNA芯片技術(shù)（大規(guī)模未知突變篩查）N4×n1.28平方cm16000個寡核苷酸

基因診斷新版專題知識第39頁2.大片段丟失或插入診療外側(cè)確定有沒有缺失及缺失片斷相對大小內(nèi)側(cè)確定缺失部位.基因診斷新版專題知識第40頁㈡多態(tài)性連鎖分析DNA多態(tài)性——在同種生物不一樣個體基因組中，常存在一些不影響基因功效DNA次序變異，稱為DNA多態(tài)性（polymorphism）基因診斷新版專題知識第41頁DNA多態(tài)性標(biāo)識限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)短串聯(lián)重復(fù)序列（shorttandomrepeat,STR）單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）基因診斷新版專題知識第42頁限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）DNA→酶切→Southern雜交分析DNA→PCR→酶切→電泳分析由串聯(lián)重復(fù)次序造成長度多態(tài)性STR含有較高信息量且輕易檢測STR由2~6個核苷酸串聯(lián)重復(fù)組成，微衛(wèi)星DNA基因診斷新版專題知識第43頁㈢基因表示異常診療mRNA相對定量分析斑點(diǎn)雜交RT—PCRmRNA絕對定量分析RT—PCR/競爭性PCR(50bp標(biāo)準(zhǔn)cDNA已知濃度)mRNA長度分析Northern雜交/RT—PCR產(chǎn)物電泳基因診斷新版專題知識第44頁㈣外源DNA檢測

核酸分子雜交

PCR技術(shù)許多病原體基因結(jié)構(gòu)已被說明，設(shè)計基因特異性探針，或合成特異寡核苷酸引物，可直接從臨床標(biāo)本中檢測病原體基因組核酸(DNA或RNA)存在，即可早期、快速、敏感、特異地確定病原體存在?；蛟\斷新版專題知識第45頁第二節(jié)基因診療應(yīng)用1、遺傳疾病2、感染性疾?。?）病毒性感染（2）細(xì)菌性感染（3）寄生蟲（4）其它基因診斷新版專題知識第46頁3、惡性腫瘤4、法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用（1）DNA指紋分析（DNAfingerprinting）（2）短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性分析（shorttandemrepeat，STR）基因診斷新版專題知識第47頁一、遺傳性疾病HbDPunjab血紅蛋白病

121位co密碼子由GAA突變位CAA，該突變造成限制酶EcoR1位點(diǎn)消失（GAATTC）鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥：

第六位密碼由GAG突變成GTG,造成不能被OxaN1酶切基因診斷新版專題知識第48頁×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正常基因5′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組限制性酶切分析OxaN1基因診斷新版專題知識第49頁+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組限制性酶切分析基因診斷新版專題知識第50頁

遺傳性疾病----DMD分子診療杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenemusculardystrophy,DMD）X染色體連鎖隱性遺傳性肌肉疾病,發(fā)病率為1/3500個男孩，是一個高發(fā)病率、高致殘、高致死X染色體連鎖遺傳性疾病。DMD基因位于Xp21.2-21.3，全長2400KbDMD基因突變造成抗肌萎縮蛋白dystrophin缺點(diǎn)基因診斷新版專題知識第51頁DMD基因外顯子缺失檢測基因診斷新版專題知識第52頁二、感染性疾病基因

診療策略針對病原體特異核酸序列設(shè)計探針進(jìn)行雜交應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增病原體基因保守序列核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用基因診斷新版專題知識第53頁SARS相關(guān)冠狀病毒分子診療

年4月，香港研究者Peiris等報告了50例SARS病人臨床表現(xiàn)和病毒學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，新冠狀病毒可能是SARS致病原因。（Lancet,,361:9365)

其它試驗室陸續(xù)得出相同結(jié)論。基因診斷新版專題知識第54頁

年4月，德國漢堡Bernhard-Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所學(xué)者Drosten

等用隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù)，取得長度為

300bp核苷酸序列。依據(jù)這段序列，建立了檢測新冠狀病毒常規(guī)和實(shí)時定量PCR技術(shù)。（onApril10,）基因診斷新版專題知識第55頁引物和探針BNIoutS2--BNIoutAsBNI-1片段，189bpBNIinS--BNIinAsBNI-1片段內(nèi)套片段，108bpBNITMSARS1—BNITMSARAs2BNITMSARP(熒光素標(biāo)識探針）產(chǎn)物長度：77bp基因診斷新版專題知識第56頁

檢測標(biāo)本痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液、血漿、糞便。檢測方法逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR

基因診斷新版專題知識第57頁討論

疾病早期即可取得陽性結(jié)果（早于血清轉(zhuǎn)換期）。特異性較高（SARS患者中陽性率約為80%，對照中陰性率約為

98%~100%）?，F(xiàn)有方法敏感性較差，陰性結(jié)果不能排除病毒感染?；蛟\斷新版專題知識第58頁討論痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道排放是主要傳輸路徑。血清中檢測到極低濃度病毒RNA，提醒病毒復(fù)制不但發(fā)生于呼吸道。病人恢復(fù)晚期糞便中存在病毒RNA，說明糞便可能也是一個傳輸路徑。鼻、咽拭子中含有病毒RNA顯著少于痰液，提醒不適合作為標(biāo)本（有可能漏檢）?；蛟\斷新版專題知識第59頁三、腫瘤基因診療

腫瘤是因為遺傳物質(zhì)（腫瘤相關(guān)基因）發(fā)生突變而造成疾病。腫瘤相關(guān)基因突變只是增加了個體對腫瘤易感性而并不一定馬上產(chǎn)生腫瘤，腫瘤發(fā)生是一個多原因、多步驟過程?；蛟\斷新版專題知識第60頁生物芯片技術(shù)在今后腫瘤發(fā)病機(jī)制研究和腫瘤診療等方面將發(fā)揮越來越顯著作用基因診斷新版專題知識第61頁檢測腫瘤相關(guān)基因癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因檢測腫瘤相關(guān)病毒基因鼻咽癌—EB，宮頸癌—HPV檢測腫瘤標(biāo)志物基因或mRNA

肝癌—甲胎蛋白（AFP）結(jié)腸癌—癌胚抗原（CEA）基因診斷新版專題知識第62頁㈠ras癌基因檢測ras基因中最常見點(diǎn)突變是第12，13或61密碼子突變檢測方法：PCR/ASOPCR-SSCP基因診斷新版專題知識第63頁㈡