實驗五質(zhì)粒酶切質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化酶切

關(guān)于實驗五質(zhì)粒酶切質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化酶切第1頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月背景知識一、質(zhì)粒圖譜的閱讀二、限制性內(nèi)切酶第2頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月

第一步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）

第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。

Ampr水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

tetr可以阻止四環(huán)素進入細胞。

camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。

neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活

hygr

使潮霉素β失活。一、質(zhì)粒圖譜的閱讀第3頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。

一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即：啟動子——核糖體結(jié)合位點——克隆位點——轉(zhuǎn)錄終止信號。

這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體的?？寺≥d體中加入一些與表達調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達載體。第4頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月農(nóng)桿菌復(fù)制起始位點大腸桿菌復(fù)制起始位點加尾信號，終止位點潮霉素抗性基因多克隆位點終止子加尾信號綠色熒光蛋白基因第5頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月二、限制性內(nèi)切酶1)概念2)命名原則3)類型4)基本特性及用途5)影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素6)Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項第6頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月1)概念限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionednonuclease)是一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的內(nèi)切核酸酶（endonuclease)的總稱。

至2006年2月共發(fā)現(xiàn)3773種限制性內(nèi)切酶，I、II、III型各有68、3692、10種，甲基化指導(dǎo)的3種，商品化的609種，II型中共有223種特異性。第7頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月2)命名原則1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原則，1980年Roberts在此基礎(chǔ)上進行了系統(tǒng)分類①限制性核酸內(nèi)切酶第一個字母（大寫，斜體）代表該酶的宿主菌屬名(genus)；第二、三個字母(小寫，斜體)代表宿主菌種名(species)。②第四個字母代表宿主菌的株或型(strain)。③若從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內(nèi)切酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。

屬名種名株系Haemophilusinfluenzae

d

流感嗜血桿菌d株

HindⅡ

HindⅢ同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶第8頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月3)類型

據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三類。第9頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月4)基本特性及用途

Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶有嚴格的識別、切割順序，它以核酸內(nèi)切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5′端為P，3′端為OH，識別序列一般為4～6個堿基對，通常是反轉(zhuǎn)錄重復(fù)順序，具有180°的旋轉(zhuǎn)對稱性即迴文結(jié)構(gòu)。Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口。5′粘性末端3種切口3′粘性末端平頭末端第10頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月第12頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途

①在特異位點上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶圖譜。③構(gòu)建基因文庫。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。⑤改建質(zhì)粒。第14頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月5)影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素

①DNA樣品純度②DNA樣品甲基化程度③酶的星活性(staractivity)第15頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月①DNA樣品純度

A）樣品雜有RNA

雖不影響酶反應(yīng)速度，但RNA很易與酶蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合而減少酶有效濃度，使酶解不徹底；另外，干擾DNA片段電泳觀察。

B）少量的蛋白質(zhì)污染對酶解影響不大，但若有核酸酶等蛋白質(zhì)污染時，會干擾酶切反應(yīng)，并影響酶解產(chǎn)物。

C）樣品中雜有其他DNA

如質(zhì)粒DNA中雜有染色體DNA，雖不影響酶解作用，但干擾酶解產(chǎn)物電泳圖譜并影響以后的重組連接反應(yīng)。

D）其他雜質(zhì)如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，會影響酶切速度，甚至改變酶的識別特異性，出現(xiàn)酶的第二活性。第16頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月②DNA樣品甲基化程度

限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列若被修飾酶產(chǎn)生了修飾反應(yīng)，則該DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，DNA甲基化現(xiàn)象廣泛的存在于原核和真核生物中。如：AccⅠ識別序列能切割不能切割注意此處的區(qū)別dam甲基化酶識別序列AccⅠTCCGGAGAT×CCGG6mATC采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質(zhì)粒DNA，可防止DNA的甲基化。第17頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月③酶的星活性(staractivity)

又稱第二活力，是指改變了酶切反應(yīng)條件后特異序列識別特性降低的一種現(xiàn)象。由于識別特異性的降低，可能對原識別序列相似的序列也產(chǎn)生切割反應(yīng)。高濃度甘油、高pH、低離子強度、巰基乙醇、DMSO、Mn2+等的存在可能導(dǎo)致酶產(chǎn)生星活性。第18頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月6)Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項

①商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時應(yīng)使用新的吸頭去取酶；加入酶的體積應(yīng)不超過總體積的10%，否則酶液中的甘油濃度超過5%時酶易產(chǎn)生星活性。②整個操作應(yīng)在0℃進行，即在冰浴中進行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。③當切割大量DNA時，通常采用延長反應(yīng)時間，減少酶的用量。④當DNA需2種或以上酶切時，應(yīng)用通用緩沖液；若沒有通用緩沖液時，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進行下一個酶切反應(yīng)。第19頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗?zāi)康模保┝私饷盖性?，掌握酶切體系建立原則２）用EcoRⅤ

切割質(zhì)粒pCAMBIA13023）用EcoRⅤ切割銀杏基因組DNA第20頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。第21頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月

限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ特異性識別位點為：

GAT

ATCCTA

TAGGATATCCTATAG產(chǎn)生平末端：第22頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月

則pCAMBIA1302經(jīng)EcoRⅤ酶切后產(chǎn)生大小分別為：1600bp、2624bp和6325bp的三條DNA片段第23頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月

基因組DNA中由于有較多的EcoRⅤ識別位點，因此，經(jīng)EcoRⅤ酶切后產(chǎn)生大小不一的條帶，電泳后整個泳道呈現(xiàn)均一的亮帶。酶切前的DNA酶切后的DNA第24頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗材料和試劑實驗材料：質(zhì)粒pCAMBIA1302銀杏基因組DNA實驗試劑：EcoRⅤ酶及其酶切緩沖液瓊脂糖(Agarose)、TAE電泳緩沖液等第25頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗儀器恒溫水浴鍋第26頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒（DNA）17.5μL反應(yīng)10×緩沖液2μL19μL0.5μL酶液+用移液槍輕輕吹打使溶液混勻，且使溶液集中在管底混勻反應(yīng)體系后，37℃水浴保溫4-5h１％瓊脂糖凝膠電泳檢測(上樣10μL電泳)EP管編號,加樣實驗步驟第27頁，課件共29頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗注意事項限制性內(nèi)切酶用量可按標準體系1μgDNA加1單位酶，消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加