酶類-葡萄糖6磷酸酶

病理檢驗技術

特殊染色

酶類葡萄糖-6-磷酸酶

葡萄糖-6-磷酸酶

葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase)分解糖原為葡萄糖進入血流,稱為肝糖原的糖化作用。此酶對維持血糖濃度的相對恒定有非常重要的作用,因此是糖代謝的關鍵酶。當血糖降低時,葡萄糖6-磷酸酶可促進肝糖原轉變?yōu)檠?當葡萄糖-6-磷酸酶缺乏時,會造成糖原分解障礙，使糖原積累在肝,腎及心等器官,這種情況稱為肝糖原儲積病,最常見的為糖原儲積病I型。

葡萄糖-6-磷酸酶最適pH為6.5,但pH在6.0-8.0范圍內(nèi)也可進行。若pH低于5.0時,酶就會變性。此酶在反應中不像大多數(shù)磷酸酶需要二價金屬陽離子作激活劑,但被氟化物、鋅和氰離子抑制。此酶是一種膜結合酶,定位于粗面內(nèi)質網(wǎng),在肝、腎和小腸黏膜含量最多,是內(nèi)質網(wǎng)的主要標志酶。需采用新鮮組織低溫恒冷切片,如組織經(jīng)甲醛短時固定,酶即可失活。葡萄糖-6-磷酸酶

硝酸鉛法(根據(jù)Dachstein和Meisel)(一)試劑配制1.0.125%的6-磷酸葡萄糖二鈉鹽2.0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷/失水蘋果酸緩沖液(pH6.7)3.2%的硝酸鉛4.孵育液：0.125%的6-磷酸葡萄糖二鈉鹽4ml、0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷/失水蘋果酸緩沖液(pH6.7)4ml、2%的硝酸鉛0.6ml、蒸餾水1.4ml，依次混合后過濾5.1%的硫化銨即配即用,不能保存6.10%的中性甲醛葡萄糖-6-磷酸酶

葡萄糖-6-磷酸酶（硝酸鉛法(根據(jù)Dachstein和Meisel)）(二)染色步驟1.新鮮組織低溫恒冷切片(用液氮快速冷凍效果更佳),厚5μm,貼于玻片,取出風扇吹干30分鐘。2.切片入預溫的孵育液于37℃的恒溫箱孵育10~20分鐘。干30分鐘。3.蒸餾水浸洗2次,每次1分鐘。4.1%的硫化銨處理1分鐘。5.流水沖水5分鐘。6.10%中性甲醛固定10分鐘。7.流水沖洗5分鐘,再用蒸餾水稍洗。8.甘油明膠封蓋。葡萄糖-6-磷酸酶（硝酸鉛法(根據(jù)Dachstein和Meisel)）(三)結果葡萄糖-6-磷酸酶活性部位呈黃棕色至棕黑色顆粒狀沉淀。(四)對照方法配育液時,用等量的蒸餾水代替0.125%的6-磷酸葡萄糖二鈉鹽,結果應為陰性。切片固定于10%的甲醛液中1小時后再進行孵育,酶被滅活,結果為陰性。葡萄糖-6-磷酸酶（硝酸鉛法(根據(jù)Dachstein和Meisel)）(五)注意事項1.6-磷酸葡萄糖的鋇鹽在儲存中較鈉鹽或鉀鹽穩(wěn)定,如使用鋇鹽,需將鋇鹽轉換為鈉鹽或鉀鹽,方法如下：取6-磷酸葡萄糖鋇鹽125mg,溶于蒸餾水5ml,加2mol/L鹽酸2~3滴,使鋇鹽完全溶解。再加入硫酸鈉或硫酸鉀60mg,此時溶液呈乳白色,于電磁攪拌器攪拌1小時,然后離心15分鐘,取其上清液,加入硫酸鈉或硫酸鉀1小粒,如未出現(xiàn)乳白色混濁,即用蒸餾水稀釋至15ml,用lmol/L氫氧化鈉調至pH6.7,如加入硫酸鈉或硫酸鉀1小粒后,仍出現(xiàn)乳白色混濁,表明對鋇鹽轉換不夠,需再加入適量硫酸鈉或硫酸鉀,然后再攪拌、離心,如無乳白混濁出現(xiàn)即可使用。2.1%的硫化銨配后不久會自行分解而失效,因此每次要臨時小量配制,一般取蒸餾水4ml加入硫化銨1滴即相當于1%。硫化銨用后要塞緊保存,否則容易失效。葡萄糖-6-磷酸酶（硝酸鉛法(根據(jù)Dachstein和Meisel)）(六)染色機制葡萄糖-6-磷酸酶分解底物6-磷酸葡萄糖,釋放出磷酸,磷酸與鉛離子結合,在酶活性部位形成磷酸鉛,后者經(jīng)硫化銨處理,形成棕黑色的硫化鉛沉淀在酶活性處。(七)應用常用于確診馮吉爾克(V