毛細管電泳原理

毛細管電泳原理作者：admin發(fā)表時間：2008-8-2814:55:41閱讀：次毛細管電泳原理毛細管電泳基本原理分離的原因：電泳遷移，電滲遷移電泳遷移：在高壓電場下，帶電離子向相反的方向移動。電滲遷移：當毛細管內充滿緩沖溶液時，毛細管壁上的硅羥基發(fā)生解離，生成氫離子溶解在溶液中，這樣就使毛細管壁帶上負電荷與溶液形成雙電層，在毛細管的兩端加上直流電場后，帶正電的溶液就會整體的向負極端移動，這就形成了電滲流。cE在操作緩沖溶液中，帶電粒子的運動速度等于電泳速度和電滲速度的矢量和，電滲速度一般大于電泳速度，因此即使是陰離子也會從陽極端流向陰極端。加大緩沖溶液的酸度、在緩沖溶液中加入有機試劑都會減少硅羥基的解離，減小電滲流分離模式毛細管電泳的分離模式有以下幾種。（1） 毛細管區(qū)帶電泳將待分析溶液引入毛細管進樣一端，施加直流電壓后，各組分按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細管出口端，按陽離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小的順序通過檢測器。中性組分彼此不能分離。出峰時間稱為遷移時間，相當于高效液相色譜和氣相色譜中的保留時間。（2） 毛細管凝膠電泳在毛細管中裝入單體和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應生成凝膠，這種方法主要用于分析蛋白質、DNA等生物大分子。另外還可以利用聚合物溶液，如葡聚糖等的篩分作用進行分析，稱為毛細管無膠篩分。有時將它們統稱為毛細管篩分電泳，下分為凝膠電泳和無膠篩分兩類。（3） 毛細管等速電泳采用前導電解質和尾隨電解質，在毛細管中充入前導電解質后，進樣，電極槽中換用尾隨電解質進行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移至各個狹窄的區(qū)帶，然后依次通過檢測器。（4） 毛細管等電聚焦電泳將毛細管內壁涂覆聚合物減小電滲流，再將樣品和兩性電解質混合進樣，兩個電極槽中分別加入酸液和堿液，施加電壓后毛細管中的操作電解質溶液逐漸形成pH梯度，各溶質在毛細管中遷移至各自等電點時變?yōu)橹行孕纬删劢沟膮^(qū)帶，而后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值的辦法使溶質通過檢測器。（5） 膠束電動毛細管色譜當操作緩沖液中加入大于其臨界膠束濃度的離子型表面活性劑時表面活性劑就聚集形成膠束，其親水端朝外憎水非極性核朝內，溶質則在水和膠束兩相間分配，各溶質因分配系數存在差別而被分離。對于常用的陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉，進樣后極強親水性組分不能進入膠束，隨操作緩沖液流過檢測器（容量因子k'=0）；極強憎水性組分則進入膠束的核中不再回到水相，最后到達檢測器（k'=8）。其他常用的膠束試劑還有陽離子表面活性劑十六烷基三甲基漠化銨，膽酸等。（6） 毛細管電色譜將細粒徑固定相填充到毛細管中或在毛細管內壁涂覆固定相以電滲流驅動操作緩沖液（有時再加輔助壓力）進行分離。以上分離模式（1）和（5）使用較多。（5）和（6）兩種模式的分離機理以色譜為主，但對荷電溶質則兼有電泳作用。操作緩沖液中加入各種添加劑可獲得多種分離效果。如加入環(huán)糊精、衍生化環(huán)糊精、冠醚、血清蛋白、多糖、膽酸鹽或某些抗生素等，可拆分手性化合物；加入有機溶劑可改善某些組分的分離效果，以至可在非水溶液中進行分析。毛細管電泳原理及在藥學領域的應用中國色譜網（2007-12-2114:16:29）文章作者：未知高效毛細管電泳（HPLC）亦即毛細管電泳（CE），是一種發(fā)展迅猛的新型的分離分析技術，與常用的高效液相色譜法（HPLC）相比，具有分析時間短，分離效率高，適應性廣，檢測限低，進樣量小，溶劑消耗少，自動化程度高等優(yōu)點，近十多年來已廣泛應用于蛋白質、氨基酸、無機離子、有機化合物、藥物的分離分析，在生物醫(yī)藥學領域倍受青睞。本文簡要介紹HPLC的基本原理、特點及在化學藥品分析、中藥分析、生物制品分析研究方面的應用，并展望其在藥學領域中的應用前景。1、HPCE的基本原理高效毛細管電泳（highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE）是近年來發(fā)展起來的一種分離、分析技術，它是凝膠電泳技術的發(fā)展，是高效液相色譜分析的補充。該技術可分析的成分小至有機離子、大至生物大分子如蛋白質、核酸等?？捎糜诜治龆喾N體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，HPLC分析高效、快速、微量［1］。1-1電泳遷移不同分子所帶電荷性質、多少不同，形狀、大小各異。一定電解質及PH的緩沖液或其它溶液內，受電場作用，樣本中各組分按一定速度遷移，從而形成電泳。電泳遷移速度（v）可用下式表示：v=uE其中E為電場強度（E=V/L，V為電壓，L為毛細管總長度）。u為電泳淌度。1-2電滲遷移電滲遷移指在電場作用下溶液相對于帶電管壁移動的現象。特殊結構的熔合硅毛細管管壁通常在水溶液中帶負電荷，在電壓作用下溶液整體向負極移動，形成電滲流。帶電微粒在毛細管內實際移動的速度為電泳流和電滲流的矢量和。1-3分離分析類型根據其分離樣本的原理設計不同主要分為以下幾種類型:①毛細管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis，CZE）；②毛細管等速電泳（capillarychromatography，CITP）；③毛細管膠速電動色譜（micellerelectrokineticcapillarychromatographyMECC）；④毛細管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）；⑤毛細管等電聚焦（capillaryisoelectricfocusing，CIEF）。毛細管區(qū)帶電泳（CZE）為HPCE的基本操作模式，一般采用磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液，實驗條件包括緩沖液濃度、PH值、電壓、溫度、改性劑（乙腈、甲醇等），用于對帶電物質（藥物、蛋白質、肽類等）分離分析，對于中性物質無法實現分離。毛細管膠束電動色譜（MECC）為一種基于膠束增溶和電動遷移的新型液體色譜，在緩沖液中加入離子型表面活性劑作為膠束劑，利用溶質分子在水相和膠束相分配的差異進行分離，拓寬了CZE的應用范圍，適合于中性物質的分離，亦可區(qū)別手性化合物，可用于氨基酸、肽類、小分子物質、手性物質、藥物樣品及體液樣品的分析。毛細管等速電泳（CITP）采用先導電解質和后繼電解質，構成不連續(xù)緩沖體系，基于溶質的電泳淌度差異進行分離，常用于離子型物質（如有機酸），并因適用較大內徑的毛細管而可用于微制備，但本法空間分辨率較差。毛細管等電聚焦電泳（CIEF）用于具兼性離子的樣品（蛋白質、肽類），等電點僅差0.001可分離的物質。毛細管凝膠電泳（CGE）依據大分子物質的分子量大小進行分離，主要用于蛋白質、核苷酸片段的分離。此外，還有毛細管電色譜CEC）及非水毛細管電泳（CNACE），用于水溶性差的物質和水中難進行反應的分析研究。目前CZE和MECC用得較多，本文以這兩種方法為例來說明HPLC的原理。1-3-1CZE的基本原理HPLC選用的毛細管一般內徑約為50|jm（20?200|jm），外徑為375|jm，有效長度為50cm（7?100cm）。毛細管兩端分別浸入兩分開的緩沖液中，同時兩緩沖液中分別插入連有高壓電源的電極，該電壓使得分析樣品沿毛細管遷移，當分離樣品通過檢測器時，可對樣品進行分析處理。HPLC進樣一般采用電動力學進樣（低電壓）或流體力學進樣（壓力或抽吸）兩種方式。在毛細管電泳系統中，帶電溶質在電場作用下發(fā)生定向遷移，其表觀遷移速度是溶質遷移速度與溶液電滲流速度的矢量和。所謂電滲是指在高電壓作用下，雙電層中的水合陰離子引起流體整體地朝負極方向移動的現象；電泳是指在電解質溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象。溶質的遷移速度由其所帶電荷數和分子量大小決定，另外還受緩沖液的組成、性質、PH值等多種因素影響。帶正電荷的組份沿毛細管壁形成有機雙層向負極移動，帶負電荷的組分被分配至毛細管近中區(qū)域，在電場作用下向正極移動。與此同時，緩沖液的電滲流向負極移動，其作用超過電泳，最終導致帶正電荷、中性電荷、負電荷的組份依次通過檢測器。3-2MECC的基本原理MECC是在CZE基礎上使用表面活性劑來充當膠束相，以膠束增溶作為分配原理，溶質在水相、膠束相中的分配系數不同，在電場作用下，毛細管中溶液的電滲流和膠束的電泳，使膠束和水相有不同的遷移速度，同時待分離物質在水相和膠束相中被多次分配，在電滲流和這種分配過程的雙重作用下得以分離。MECC是電泳技術與色譜法的結合，適合同時分離分析中性和帶電的樣品分子】2］。2、HPLC在各類藥物中的應用藥品是與人們生命息息相關的特殊商品，檢驗其真?zhèn)位蛸|量的優(yōu)劣，需要先進、快速、準確的定性和定量手段。因此，HPCE分析技術很快即被藥物分析工作者在藥品檢驗領域迅速推廣應用［3、4］。國內自1989年起曾有學者報道，但研究和應用實例不多。近1?2年發(fā)展迅速，并取得了顯著成績。1化學藥品分析化學藥品結構簡單、清楚，常規(guī)分析方法能基本解決定性、定量和純度控制等問題。但有些結構特異（如手性對映體結構）或性質特殊的品種，現代分析手段從靈敏度、分辨率和分析速度等方面，仍有一些難點°HPCE技術的特點、優(yōu)勢，恰恰彌補和解決了某些分析手段的不足。應用實例有單體，也有復方制劑：＜BR＞牛長群等】5］用HPCE法，50mmol.l-1緩沖液（ph8.3），分離測定了氨芐青霉素的聚合物。大部分樣品以開環(huán)和閉環(huán)的二聚物為主要聚合體，可對多個組分進行定量，以控制此類致敏成分對氨芐青霉素的質量影響。李關賓等［6］用自制的CE-電化學檢測系統，對VC、VB1和VB6的CZE和MECC的分離與檢測表明，在0.01mol.l-1NH3-NH4CL介質中，檢測電勢510?540mV，3種維生素均得到較好的分離和CZE圖譜。李小戈等采用MECC，Na2B4O2-SD緩沖體系，4min內對5種水溶性維生素VC、VB1、VB2、VB6和VB12進行了有效分離，分辨率高，重現性好，令人滿意。廉經武等［7］以B環(huán)糊精的兩種衍生物作CE的手性分離添加劑，對鹽酸美西律的對映體進行分析。其中，2,6-0—二甲基B—環(huán)糊精可將對映體部分拆分，而用三甲基環(huán)糊精作手拆添加劑時，則可使對映體定量達到基線分離。俞琦等［8］用HPLC和二極管陣列檢測器，環(huán)糊精為拆分劑，含DM—p-CD40mmol-L—1.KH2P0470mmol-L—1（pH2.5）的緩沖劑，對氧氟沙星對映體進行了優(yōu)化分離。張文江等［9］采用HPLC模式，選用4X10%—2mmol?L—1Tris—H2P04（pH3.6）—6.5x10—2mol-L—1g—環(huán)糊精，分離了海南新堿衍生物HH07A異構體，并應用于肝微粒體中代謝的查體選擇性研究。孫發(fā)山等［10］用HCZE模式，50mmol?L—1磷酸鹽緩沖液（pH9°67），取血漿直接進樣測定復方頭孢氨芐膠囊中頭孢氨芐的含量，只需樣品5Ml，10min內一次完成，方法非常適合血藥濃度檢測。劉新宇等［11］以茶堿為內標，用KH2P04—硼酸緩沖系統（PH8.5），建立了泰諾復方感冒片中撲熱息痛、鹽酸偽麻黃堿、氫漠酸美沙芬、馬來酸撲熱息痛和苯甲酸鈉5種成分的含量測定方法，10min完成定量。2-2中藥分析中藥品種繁多、藥材產地各異、成分復雜，無論是藥材還是成藥的分析，都是一項非常艱難的任務。中藥分析工作用現代化儀器設備和科技手段（如薄層色譜、HPLC等）雖取得巨大進展和成就，但往往只是對藥材和成藥成百上千個成分中的一個或幾個成分的分析，實際只是一種象征性的代表式分析，與之起化學和藥理效應的實際組合成分（起碼是有效成分）相比，仍有相當大的距離。隨著CE技術對中藥材及其有效成分的鑒別與分析的快速發(fā)展，建立在此基礎上的中成藥成分的定性、定量分析已有進展，且有希望解決長期困擾中藥質量控制中的重大難題。近年，報道HPCE分析中藥材已有18種、成藥70種和有效成分120個以上。LiuYM等采用CEC模式，85%0.1mol?L—1的乙酸鈉緩沖液加15%甲醇作流動相，13min內分離黃連中的小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、非洲防己胺、藥根堿、加倫巴胺、木蘭花堿、黃連次堿。用50%0.2mol?L—1乙酸鈉加50%乙腈作流動相，8min可內分離黃連中的黃連次堿、小檗堿和巴馬亭。張國華等［12］則用65%NaH2PO4緩沖液加35%甲醇作流動相，分離了黃連中小檗堿、巴馬汀和藥根堿等7種生物堿°LiuYM等還用磷酸緩沖液5mmol、Ba（OH）2和20mmol異亮胺酸作緩沖液，pH10條件下10min分離了麻黃中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、去甲基麻黃堿和去甲偽麻黃堿。改用10mmol?L—1頡胺酸作緩沖液時，僅用3min即分離了麻黃堿和偽麻黃堿°LiKL和ShenSJ以膽酸鈉作膠束，用MECC模式成功地分離測定了黃苓和黃連混合物中的黃連次堿、小壁堿、表小壁堿和巴馬亭4種生物堿及黃苓素等6種黃酮。又在20mmol?L—1SDS10mmol?L—1NaH2PO4系統中，加入12.5mmol?L—1硼砂，25min內分離了黃苓中漢黃苓素、漢黃苓素一7一。一葡萄糖甙、貝加因、貝加靈、木蝴蝶素A和木蝴蝶素A7—O—葡萄糖甙酸。宋玉英等［13］在25mmol?L—1SDS中，加入25mmol?L—13—環(huán)己氨基一1一丙基磺酸—乙月青作改性劑，分離測定了大黃、蘆薈中的大黃素、大黃酸等。國外有人用等束單電泳分離了大黃和番茄葉中的蒽醍類番茄甙A和B的含量°Chen等［14］用MECC模式，50%20mmol?L—1磷酸二氫鈉加20%乙月青，pH7.5,10min分離了甘草中甘草酸和甘草次酸。Iwagami則在0.lmol?L—l—SDS硼砂、磷酸緩沖系統中加入膽酸鈉，25min