植物脫毒快繁技術

關于植物脫毒快繁技術第1頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月一、病毒危害

多數(shù)栽培植物，尤其無性繁殖植物，都易受到一種或幾種，甚至幾十種病毒的侵染。例如，草莓染60多種病毒。并且隨著培養(yǎng)時間的推移，侵染病毒的種類越來越多。植物病毒病原體可通過維管束傳導。因此，對無性繁殖的植物來說，一旦感染上病毒之后，就會代代相傳越趨嚴重。受病毒侵染的植物生長緩慢、畸形、產量大幅度下降，品質變劣，甚至完全喪失商品價值。第2頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

目前，對細菌和真菌侵染的病害，可通過藥物處理達到治愈的目的。但還沒有治病毒的特效藥。種子一般不帶病毒(豆類植物除外)，種子繁殖可得無毒植株。但對于無性繁殖植物，必須采取一些特殊方法脫除病毒。第3頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月脫毒快繁的一般過程

1、診斷：首先了解供試材料感染病毒的種類2、莖尖培養(yǎng)脫毒或結合熱處理3、鑒定4、繁殖5、馴化移植第4頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、熱處理脫毒原理：

①病毒進入植物細胞后，隨植物細胞DNA一起復制。熱處理并不能殺死細胞，只是鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內增殖減緩或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。②熱處理是一種物理效應，可加速植物細胞分裂，在激烈分裂的細胞中正常核蛋白合成占優(yōu)勢，使植物細胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。因此加速分生組織細胞的分裂，能夠獲得無病毒植株。

二、脫毒方法

(一)

熱處理脫毒第5頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

依據(jù)病毒對高溫的敏感，寄主耐高溫。利用這一差異，選擇適當?shù)臏囟群吞幚頃r間，進行高溫處理，就能使寄主體內病毒濃度降低，傳遞速度減慢或失去活性，而寄主細胞仍然存活，并加快分裂和生長。第6頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月(1)溫湯浸漬處理(2)熱空氣處理2、熱處理脫毒方法第7頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）溫水浸漬處理

適用于休眠器官，在50℃左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時，方法簡便易行，但易使材料受傷。

第8頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）熱空氣處理

熱空氣處理對活躍生長的莖尖效果較好。將生長的盆栽植株移入溫熱治療箱內，一般35-40℃。處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達數(shù)月。第9頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月熱處理廣泛應用于葡萄、草莓、馬鈴薯和菊花等植物。如：葡萄置于38℃可去除扇葉病毒。熱處理對葡萄扇葉病毒、草莓斑駁病毒、蘋果花葉病毒等球形病毒有作用，而對另一些病毒不起作用，因此，必須與莖尖培養(yǎng)相結合脫毒效果更好。第10頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

植物的去病毒技術，實質上就是采取不含病毒顆粒或病毒顆粒含量甚少的0.1～0.5mm帶1～2個葉原基的莖尖作為外植體，進行微繁殖，使其培養(yǎng)成完整的無病毒小植株的技術。（二）莖尖培養(yǎng)脫毒第12頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、莖尖培養(yǎng)脫毒原理

病毒在植物體內分布不均勻，其數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域，病毒感染的程度越低，生長點即分生組織（約0.1-1mm）幾乎不含或含病毒很少。

第13頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、傳導抑制。植物體病毒的移動主要靠2條途徑：一是通過維管系統(tǒng)，而分生組織中尚未形成維管系統(tǒng)；二是通過胞間連絲，但這條途徑病毒移動速度非常慢，趕不上莖尖和根尖細胞不斷分裂和活躍的生長速度。

2、酶缺乏。莖尖中缺乏病毒合成所需的酶系，存在高水平內源激素，可抑制病毒的增殖。

莖尖分生組織不帶病毒，可能有4方面的原因：第14頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月3、能量競爭。當植物細胞分裂DNA復制時，病毒DNA隨著復制。因此，植物細胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競爭。在旺盛分裂的分生組織中，代謝活動很高，正常核蛋白合成占優(yōu)勢，使病毒無法進行復制。4、抑制因子存在。在植物體內存在有一種“病毒鈍化系統(tǒng)”（抑制因子假說），在分生組織中的活性最高，因而使分生組織不受侵染。第15頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月2、培養(yǎng)基

一般以White、MS為基本培養(yǎng)基，提高鉀鹽和銨鹽含量有利于莖尖生長。MS培養(yǎng)某些植物莖尖時，有些離子濃度過高應稀釋。在雙子葉植物中，激素可能在第2對葉原基中合成，所以莖尖的圓錐組織生長激素不能自給，必須加入生長素與細胞分裂素，濃度要合適。在生長素中應避免用易促進愈傷組織化的2，4-D，宜用NAA或IBA；細胞分裂素用KT或BA；GA3對某些植物莖尖培養(yǎng)有用。第16頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月材料選擇、消毒微莖尖的剝取接種3、莖尖的培養(yǎng)方法第17頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月3、莖尖的培養(yǎng)方法

需要一臺解剖鏡（8-40倍）。剝離莖尖要迅速并盡快接種，或在一個襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內進行操作，以防莖尖變干。莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴密保護，只要仔細解剖，(無須表面消毒)就可得到無菌的外植體。有時消毒處理會增加培養(yǎng)物的污染率。即：葉片包被嚴緊的芽，如菊花、蘭花，只須75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹、馬鈴薯等，則要用0.1%次氯酸鈉表面消毒10min。第18頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月莖尖長（ｍｍ）葉原基數(shù)小植株數(shù)脫毒植株數(shù)脫毒率（％）0.1215024480.272421842.90.646400離體莖尖大小對馬鈴薯脫毒效果的影響切取莖尖越小脫毒效果越好，但太小不易成活，過大又不能保證完全除去病毒，所以莖尖大小要合適。第19頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

剝取莖尖過程:

解剖鏡下用解剖針將葉片剝掉，解剖針要常消毒。當一個半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將帶1-2個葉原基的分生組織切下，接到培養(yǎng)基上。

將接種的莖尖置于22℃左右溫度下。2000-3000lx16h/d光照下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數(shù)月才能成功。第21頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器官的培養(yǎng)相同。

莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無病毒苗最廣泛和最重要的一個途徑。

第22頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月4、影響微莖尖成活及脫毒的因素

（1）母體材料病毒侵染程度被單一病毒感染的植株脫毒較容易，復合感染的較難。（2）外植體大小

在最適培養(yǎng)條件下，外植體的大小決定莖尖的存活率，外植體越大，產生再生植株的機會也就越多。除了外植體的大小之外，葉原基的存在與否也影響分生組織形成植株的能力，一般認為，葉原基能向分生組織提供生長和分化所必需的生長素和細胞分裂素。第23頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）培養(yǎng)條件

在莖尖培養(yǎng)中，光下培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)效果好，如馬鈴薯莖尖培養(yǎng)時，當莖已長到1cm高時，光照強度便增加到4000lx。

（3）外植體的生理狀態(tài)

莖尖最好要由活躍生長的芽上切取。

取芽的時間也很重要，一般選萌動期較好。否則采用適當?shù)奶幚恚蚱菩菝卟拍苓M行。

第24頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）莖尖與熱處理相結合方法

能克服單獨莖尖培養(yǎng)時，莖尖過小成活率太低，莖尖太大又脫除不掉病毒的缺點。1、熱處理后取較大莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。2、取莖尖（或莖段）培養(yǎng)獲得無菌苗。然后將試管苗熱處理，再取莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。第25頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）其它途徑脫毒

1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒2、莖尖微體嫁接3、化學療法脫毒

第26頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒

愈傷組織細胞帶病原菌不均一，部分細胞不帶病毒，由這些細胞再生的植株是無病毒的。多次繼代的愈傷組織中病毒含量下降，甚至檢測不出病毒。第27頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

愈傷組織的某些細胞不帶病毒原因：1、病毒的復制速度趕不上細胞的增殖速度；2、有些細胞通過突變獲得了抗病毒的抗性。愈傷組織脫毒的缺陷是植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會產生變異植株。第28頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月2、莖尖微體嫁接

木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植培育，再從成年無病樹枝上切取0.4-1mm莖尖，在砧木上進行試管微體嫁接，以獲得無病毒幼苗。第29頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月3、化學療法脫毒

病毒抑制劑第30頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月三、脫毒快繁材料的選擇

應注意以下幾點：1）品種要可靠2）要選擇經當?shù)卦耘啻_認的高產優(yōu)質的品種來作為脫毒材料3）名貴的植物良種4）植物生長旺盛期，再生率高，脫毒效果好

第31頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月四、植物病毒的鑒定

1、外觀判斷法2、指示植物法3、抗血清鑒定法4、電子顯微鏡檢查法5、酶聯(lián)免疫鑒定法(ELISA)

第32頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月1、外觀判斷法：

帶病毒株往往葉片發(fā)黃，凹凸不平，畸形，可根據(jù)這些表現(xiàn)來判斷。但有些病毒表現(xiàn)不明顯，僅靠這一方法還不夠。第33頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月2、指示植物檢測法：

指示植物又稱鑒別寄主，指的是對某種或某些特定病毒非常敏感，而且癥狀表現(xiàn)十分明顯的植物。通常不同病毒應選用不同的植物。馬鈴薯病毒常用指示植物有千日紅、曼陀羅、豇豆、辣椒等。

分為2種①汁液感染法（摩擦接種法）②嫁接檢測法第34頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月3、抗血清鑒定法（抗原－抗體反應）

原理：由于病毒是由蛋白質和核酸組成的，是一種較好的抗原。將病毒給動物注射后產生抗體?？乖涂贵w結合產生血清反應?？乖翰《尽？贵w：是指生物體在外來抗原的刺激下產生的一種免疫球蛋白，主要存在于血清中，含抗體的血清稱為抗血清。4、電子顯微鏡檢查法

直接觀察有無病毒存在，并根據(jù)病毒的大小、形狀和結構等來判斷病毒種類。第35頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

5、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)

enzymelinkedimmunosorbentassay

把抗原-抗體的免疫反應于酶的催化反應相結合而發(fā)展起來的一種綜合性技術，靈敏度高，特異性強，發(fā)展最快應用最廣的方法。原理：采用酶標記的特異抗體指示抗原-抗體的結合，從而檢測樣品中的抗原定量測定法。第36頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。(2)加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。(3)加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。(4)加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。第37頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月五、快速繁殖

莖尖培養(yǎng)得到的脫毒苗不多，用于生產需擴大繁殖。

擴繁方法：1）組培快繁2）無毒苗栽到土壤中進行擴繁。如甘薯、草莓等利用蔓，馬鈴薯、姜、蒜等利用地下部分繁殖。為了預防病毒再感染，擴繁應在培育溫室或防蟲罩內，因為昆蟲傳播病毒。3）兩種方法相結合，試管內擴繁，移栽后再擴繁。

第39頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月注意：1、培養(yǎng)變異的產生，應及時去除2、脫毒苗并非永遠是無毒苗，由于昆蟲等的傳播，不免會再感染病毒，所以要經常脫毒，一般脫毒苗用1－3代。脫毒試管苗為原原種－－繁殖一代為原種－－原1代－－原2代第40頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月楓樹快繁圖示第41頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月楓樹快繁圖示第42頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月月季快繁圖示第43頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月月季快繁圖示第44頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月月季快繁圖示第45頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月月季快繁圖示第46頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月腋芽在生根培養(yǎng)基中生長兩周，即可有小的幼根生成，三周后，幼根可長至2cm長。將上述月季苗經過煉苗后，從培養(yǎng)基中取出，小心地洗去根上的培養(yǎng)基，然后將其接種在培養(yǎng)介質中(營養(yǎng)土:蛭石:珍珠巖=3:1:1)，再將培養(yǎng)介質澆透水，用保鮮膜封上，以防止水分的散失，然后將其放在弱光、濕度大的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待長出新根后，可移入田間土壤中。具體過程如下圖：月季快繁圖示第47頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月植物快繁的一般程序1.無菌母體植株的制備：（取材、植物激素、防止褐化和有害物積累）2.不定芽增殖：（增殖的途徑：誘導形成大量胚狀體；誘導形成大量不定芽；促進腋芽的快速形成；愈傷組織增殖）3.完整植株的形成：4.再生植株的馴化：5.再生植株的鑒定：（植物形態(tài)學鑒定；細胞學鑒定）第48頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）離體繁殖的一般技術1.外植體的選擇(1)根據(jù)培養(yǎng)目的選擇(2)考慮種質、取材大小、時期和材料的生理狀態(tài)，具有代表性第49頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月2．培養(yǎng)物的增殖植物的種類和自然生長習性不同，其增殖方式及所采取的相應技術措施也不一樣。一般來講，培養(yǎng)物的增殖有以下4種方式

第50頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月①芽增殖特點主要表現(xiàn)在培養(yǎng)方法簡單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，能長期繼代繁殖。目前采用這一方式快速繁殖的