羅氏實時熒光定量儀

定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報告：使用EB內(nèi)插染料法插至雙鏈DNA，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強度PCR循環(huán)=雙鏈DNA=染料=熒光后來用與雙鏈DNA有更強結(jié)合力的SYBRGreenI取代EB目前一頁\總數(shù)四十頁\編于十九點熒光定量實時PCR與普通PCR的比較實時在線監(jiān)控對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控，能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應的對數(shù)期降低反應的非特異性使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應的特異性增加定量的精確性全程監(jiān)控，準確的算法進行定量結(jié)果分析更加快捷方便，無需跑膠目前二頁\總數(shù)四十頁\編于十九點

羅氏產(chǎn)品介紹以及與同類產(chǎn)品之間的對比目前三頁\總數(shù)四十頁\編于十九點一、LC1.5和LC2.0LightCycler熒光定量PCR系統(tǒng)

LC1.5LC2.0目前四頁\總數(shù)四十頁\編于十九點Lightcycler1.5結(jié)構(gòu)分析以空氣加熱及冷卻迅速改變溫度帶有極高表面積/容量比例的密封20l毛細管加熱線圈可容納32個樣品的卡盤將熒光儀定位的分檔器發(fā)動機將樣品置于光學儀上的分檔器發(fā)動機熱室風扇濾器免維護的LED光源光學倍增管目前五頁\總數(shù)四十頁\編于十九點Lightcycler2.0結(jié)構(gòu)分析空氣加熱系統(tǒng)LED激發(fā)光源PMT檢測系統(tǒng)光纖目前六頁\總數(shù)四十頁\編于十九點熱力學結(jié)構(gòu)特點：1、空氣加熱2、毛細管反應體系優(yōu)點:1、升降溫速度快（0.05℃-20℃/秒），2、體系均一，不存在邊緣現(xiàn)象3、把反應體系縮小到0-20ul，節(jié)省試劑成本實現(xiàn)快速PCR目前七頁\總數(shù)四十頁\編于十九點光學結(jié)構(gòu)特點：1、免維護的LED冷光源，壽命長達2萬小時以上2、光學倍增管（Rodenstock）3、多達6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）實時檢測優(yōu)點：1、毛細管光學特性將光線散射、衍射降至最低，避免LED功率低的問題2、免維護，帶自動檢驗功能3、輕易實現(xiàn)內(nèi)標、內(nèi)對照及多重PCR目前八頁\總數(shù)四十頁\編于十九點LightCycler

結(jié)構(gòu)分析激發(fā)光源

Rodenstock-LED（發(fā)光二極管）

冷光源，免維護，開機可以馬上進行操作。

檢測系統(tǒng)光學倍增管(PMT)靈敏度高，寬檢驗范圍,背景低，無邊緣效應

加熱方式空氣加熱管間差小，熱傳導速率20℃/秒，溫控變化準確（0.05-20℃/秒）。

反應體系

兩種石英玻璃毛細管體系(20ul和100ul)

光學性好，反應體系小，節(jié)約試劑成本,適合多種用途。檢測光路范圍

530nm,555nm,610nm,640nm,670nm,710nm.六個波長，并解決相關(guān)熒光素熒光干擾問題目前九頁\總數(shù)四十頁\編于十九點LightCycler軟件4.0

更先進的自動定量方法全新的相對定量軟件全自動熔點曲線分組全自動熔點溫度提示簡化數(shù)據(jù)和用戶管理目前十頁\總數(shù)四十頁\編于十九點PCR領(lǐng)域最聰明的革新–LightCycler熒光定量PCR系統(tǒng)超高速

30至40分鐘完成PCR過程實時在線監(jiān)測收集每一循環(huán)的數(shù)據(jù)并立即顯示于聯(lián)機電腦上高靈敏在一個基因組當量中可檢測出單基因拷貝范圍廣可檢測10－1010拷貝線性范圍，無需稀釋樣品開放性全開放，成為國內(nèi)外試劑廠家的首選開發(fā)平臺六個熒光通道輕易實現(xiàn)內(nèi)標、內(nèi)對照或多重PCR最小化

定量反應體積降至10－20ul，費用低廉靈活性

支持水解探針、雜交探針及

SYBRGreenI閉管分析

消除污染風險目前十一頁\總數(shù)四十頁\編于十九點Lightcycler的分析模式適用于所有的通用探針及染料分析模式：SYBRGreenI（熒光染料）TaqMan（水解探針）Molecularbeacon（分子信標）Lightcycler上開發(fā)獨有的分析模式：HybridizationProbeFormat（雜交探針）SimpleProbe（單探針）目前十二頁\總數(shù)四十頁\編于十九點

SYBR-GreenI檢測模式

SYBRGreenI能選擇性地與雙鏈DNA結(jié)合，在外界光源激發(fā)下產(chǎn)生強烈熒光。在PCR過程中，SYBRGreenI可與新合成地雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生地熒光信號強度與雙鏈DNA含量成正比，熒光檢測在每一循環(huán)的延期后進行。SYBRGreenI與非特異性雙鏈DNA（如引物二聚體）結(jié)合產(chǎn)生的干擾可通過融解曲線分析而得到解決。目前十三頁\總數(shù)四十頁\編于十九點

水解探針（Taqman）檢測模式

同時標記有熒光發(fā)光分子和熒光淬滅分子的一條探針在激發(fā)光作用下，發(fā)光分子所產(chǎn)生的熒光可被淬滅分子吸收，因而檢測不到熒光。在PCR延伸時，因Taq酶具有的5，－3，核酸外切酶活性，可降解熒光探針，使熒光發(fā)光分子與熒光淬滅分子分開，在外界光源激發(fā)下即可發(fā)出熒光，熒光強度與PCR擴增產(chǎn)物量有關(guān)。目前十四頁\總數(shù)四十頁\編于十九點

分子信標（MolecularBeaconProbe）獨特的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，由非特異的頸和特異的環(huán)組成，探針的5’端標記熒光分子，3’端標記一個吸收或淬滅熒光的分子。自身環(huán)化時儀器檢測不到熒光，在PCR反應的退火階段，探針因與模板鏈雜交而打開，使5’端熒光分子與3’端吸收或淬滅熒光的分子分開，儀器就會檢測到熒光信號。每一個循環(huán)，隨著PCR擴增產(chǎn)物的增加，熒光信號會增強，從而根據(jù)熒光信號的增強來計算PCR擴增產(chǎn)物的增加量。目前十五頁\總數(shù)四十頁\編于十九點雜交探針（HybProbe）檢測模式

設(shè)計與檢測區(qū)互補的分別帶有不同染料標記的一對寡核苷酸（既雜交探針），在與擴增的DNA片斷雜交時，兩種染料互相接近。其中供體熒光染料受外來光源激發(fā)后，將能量傳遞給附近的受體染料，既發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），從而釋放出受體染料分子的發(fā)射波長熒光信號。熒光信號的強度和DNA的產(chǎn)量成正比。其他非特異性產(chǎn)物由于不會與探針雜交，因而不產(chǎn)生信號干擾。目前十六頁\總數(shù)四十頁\編于十九點

AnnealingElongationEndofElongationDenaturationFluoresceinLCRedforsequencespecificdetectionofDNA雜交探針檢測－羅氏專利性技術(shù)目前十七頁\總數(shù)四十頁\編于十九點Template:Plasmid;Target:CycA;DetectionFormat:HybridizationProbesStandardCalculated

concentration9.522E+91.024E+99.433E+71.127E+71.029E+69.902E+41.021E+49.217E+29.276E+11.085E+1H2O1.0E+101.0E+91.0E+81.0E+71.0E+61.0E+51.0E+41.0E+31.0E+21.0E+1H2O雜交探針的優(yōu)點：1.靈敏度高2.寬動力學范圍3.特異性高4.可用于突變分析MonitoringofPCRwiththeLightCycler

UsingHybridizationProbes目前十八頁\總數(shù)四十頁\編于十九點

專用于SNP基因分型和突變檢測的SimpleProbeSimpleProbe作為一種獨特的雜交探針只含有一條寡核苷酸探針，能夠特異性的與目的基因上含有SNP位點的靶序列結(jié)合。探針與靶序列結(jié)合后，釋放出能夠被檢測到的熒光信號，通過對熔點曲線分析中探針釋放的熒光信號強度的分析，可以得到對目的基因的多態(tài)位點的準確分析結(jié)果。目前十九頁\總數(shù)四十頁\編于十九點Denaturationphase:SimpleProbefreeinsolution;emissionofreporterdyeisquenchedAnnealingphase:Fluorescencefromreporterdyeincreaseswhenprobeisannealedtoit‘scomplementarytarget5‘3‘-pQR3‘5‘primer5‘3‘-pQRNewProbeFormat:SimpleProbeFormat

-高效低成本的新型探針R=Reporter(Fluorescein)Q=Quencher目前二十頁\總數(shù)四十頁\編于十九點熒光定量PCR儀的部分應用醫(yī)學相關(guān)研究

疾病的臨床早期診斷病原體的含量檢測合理用藥分子水平的療效研究疾病的發(fā)病監(jiān)控研究腫瘤相關(guān)基因腫瘤、耐藥基因的檢測研究組織或培養(yǎng)細胞中mRNA的表達水平－各種處理對細胞mRNA含量變化的影響－比較染病組織與正常組織中各種mRNA含量差異DNA或RNA的轉(zhuǎn)染量與實驗結(jié)果關(guān)系的研究基因分型及SNP分析轉(zhuǎn)基因動物及植物研究目前二十一頁\總數(shù)四十頁\編于十九點重點問題說明超高速的熱循環(huán)——由于采用空氣迅速改變溫度，以及利用有高表面積/體積比的光學玻璃毛細管模式，使升降溫速度最高可達20℃/秒，溫控≤0.2℃，每20～30分鐘便能完成30～40個循環(huán)。升降溫數(shù)率唯一可調(diào)——可以根據(jù)實驗的需要調(diào)整升降溫速率的系統(tǒng)0.05~20℃/秒，優(yōu)化實驗。目前二十二頁\總數(shù)四十頁\編于十九點配套功能強大的分析軟件：（1）絕對定量（具“單點定標”功能）（2）相對定量（可進行效率校正）（3）自動基因分型（SNP）（4）顏色干擾校正獨特的熔點曲線分析功能，可進一步作PCR后分析：---檢測非特異擴增并作矯正---鑒別基因型而又無需采用測序凝膠---檢測點突變，并可利用雙色檢測及顏色補償軟件在同一反應中分析較復雜的突變目前二十三頁\總數(shù)四十頁\編于十九點

為什么使用DNase-Free&RNase-Free的光學玻璃毛細管?玻璃反應管可加快熱傳導速率.毛細管增加表面積/體積比，確?？諝夂头磻煞种g的溫度迅速平衡，溫度均一.縮短了PCR反應時間，特別是熒光激發(fā)的時間，保證了反應成分的穩(wěn)定性，尤其是熒光染料的穩(wěn)定性。縮小反應體系，降低檢測成本。光學玻璃毛細管的材料適合熒光訊號的測定，類似光纖的形狀，保證熒光訊號的準確捕獲。沒有邊緣效應.目前二十四頁\總數(shù)四十頁\編于十九點LightCycler/毛細管/試劑的成本核算儀器的維護費用LightCycler是免維護的儀器,采用的光源是普通的發(fā)光二極管，壽命長達20000小時以上，非常穩(wěn)定，價格低廉。而鹵素燈光源，壽命<2000小時，發(fā)光強度衰減明顯，需要定期更換，價格昂貴。單一反應成本的計算單一反應成本包括試劑成本和反應管成本，由于毛細管的反應體系是10~20ul，而其他同類機器的反應體系是50ul，所以使用LC試劑的成本可以減少至少一半。目前二十五頁\總數(shù)四十頁\編于十九點LightCycler其他機型反應管價格0.45USD0.12USD反應體系10~20ul50ul反應液/試劑成本2.4USD4.8USD總反應成本2.85USD4.92USD目前二十六頁\總數(shù)四十頁\編于十九點LC1.5與同質(zhì)產(chǎn)品的對比項目ROCHE

LightCycler1.5ABI

ABI7300

MJOPTICONI

備注

光源

LED（發(fā)光二極管）冷光源，免維修，開機可以馬上進行操作，壽命>20000小時。鹵素燈。壽命短，需預熱，壽命2000小時。LED（發(fā)光二極管）,每一個孔位一個獨立的激發(fā)光源和檢測裝置。LightCycler光源無需定期更換，穩(wěn)定方便，光路相同，樣本誤差最小，節(jié)約成本。加熱方式

空氣加熱，溫控變化準確（±0.4℃）半導體加熱制冷（溫控±0.5℃）半導體加熱制冷（溫控±0.5℃）LightCycler變溫速度快，溫控精確。升降溫速度熱傳導速率20℃/秒，（0.05-20℃/秒)熱傳導速率2.5℃/秒熱傳導速率2.5℃/秒LightCycler升降溫速度快，并可調(diào)節(jié)運行時間

30－40分鐘

2－3小時

1.5－2.5小時

LightCycler檢測時間短，快速出結(jié)果，應用最靈活單點定標功能軟件可支持單點定標功能無無LightCycler每次實驗節(jié)約反應管和反應試劑4－5份，且單點擬合確保實驗結(jié)果反應管反應體系(定量)石英玻璃毛細管10-20ul薄壁塑料管50ul－100ul專用薄壁塑料管50ul－100ul石英玻璃管熒光檢測靈敏度好，導熱快,試劑用量省目前二十七頁\總數(shù)四十頁\編于十九點項目ROCHE

LightCycler1.5ABI

ABI7300

MJOPTICONI

備注

光路波長及熒光接收模式530nm,640nm,710nm.并解決相關(guān)熒光素熒光干擾問題，光電雜合模式4通道，無顏色補償功能,CCD鏡頭模式(需使用Rox染料進行校正,占用一個通道,實際只有3個通道可用)1通道，無顏色補償功能,96個LED光源分別檢測LightCycler檢測波長經(jīng)過優(yōu)化，檢測范圍廣泛，通道間相距較遠，干擾最小，而且通過顏色補償功能可將干擾降到最低程度檢測方式

實時檢測在線觀測（每一循環(huán)光強度變化，溫度變化，反應時間均可觀測）實時檢測在線觀測實時檢測在線觀測LightCycler可實時檢測整個PCR過程，也能在PCR運行中根據(jù)試驗需要進行實驗條件的調(diào)節(jié),使用靈活.試劑定量方法Hybridizationprobes(雜交探針):(定量和熔點曲線分析，擴增范圍100-1000bp）·TaqMan探針·SYBRGREENI·分子航標TaqMan探針（定量，解鏈曲線分析,擴增范圍50-150bp〕SYBRGREENI·分子航標TaqMan探針（定量，解鏈曲線分析,擴增范圍50-150bp〕SYBRGREENI·分子航標LightCycler使用的熒光檢測模式最多，對于各種臨床檢測和科研實驗，應用最為廣泛動力學范圍10X7X7XLightCycler檢測線性范圍廣泛，無需特別處理樣本目前二十八頁\總數(shù)四十頁\編于十九點LC2.0與同質(zhì)產(chǎn)品的對比項目ROCHE

LightCycler2.0ABI

ABI7500

MJOPTICONⅡ備注

反應管反應體系(定量)石英玻璃毛細管10-100ul薄壁塑料管50ul－100ul專用薄壁塑料管50ul－100ul石英玻璃管熒光檢測靈敏度好，導熱快,試劑用量省光路波長及熒光接收模式六通道，530nm,560nm,610nm,640nm,670nm,710nm.并解決相關(guān)熒光素熒光干擾問題，光電雜合模式五通道，無顏色補償功能,CCD鏡頭模式(使用的探針染料增加)2通道，無顏色補償功能,96個LED光源分別檢測LightCycler檢測波長經(jīng)過優(yōu)化，檢測范圍廣泛，通道間相距較遠，干擾最小，而且通過顏色補償功能可將干擾降到最低程度目前二十九頁\總數(shù)四十頁\編于十九點二、LC480LightCycler?480實時熒光定量PCR系統(tǒng)目前三十頁\總數(shù)四十頁\編于十九點高靈敏可檢測單拷貝基因

動力學范圍廣可檢測10－1010個拷貝

高重復性重復性高，CV＜0.3％

高分辨率輕松區(qū)分1000拷貝以下2倍濃度差異

高速40分鐘完成40個PCR循環(huán)

技術(shù)創(chuàng)新采用Therma-BaseTM熱循環(huán)專利技術(shù)和先進的光學檢測系

統(tǒng)，徹底消除邊緣效應，保持穩(wěn)定優(yōu)異的檢測結(jié)果。

靈活分析模式多樣，絕對定量，相對定量，融解曲線分析等幾乎適用所有的檢測模式（SYBRGreenⅠ，TaqmanProbe，Hybprobe，SimpleProbe等）

模塊化可互換的96孔，384孔加熱模塊，用戶可以自助更換模塊，不需要工程師到場

自動化平臺配以LIMS系統(tǒng)及自動進樣機械臂，可實現(xiàn)遠程操作及全

自動化運作

用戶界面友好軟件直觀簡潔，易操作

LightCycler?480系統(tǒng)主要特點目前三十一頁\總數(shù)四十頁\編于十九點LightCycler?480系統(tǒng)主要參數(shù)溫度控制37℃－95℃最大升溫速率4.8℃最大降溫速率2.5℃激發(fā)光源標準氙燈檢測裝置冷CCD濾鏡激發(fā)波長（nm）：450，483，523，558，615發(fā)射波長（nm）：500，533，568，610，640，670軟件功能絕對定量、Tmcalling、含效率校正的相對定量、基因分型、產(chǎn)物鑒定等。目前三十二頁\總數(shù)四十頁\編于十九點創(chuàng)新的PCR熱循環(huán)模塊設(shè)計Therma-BaseTM是一個內(nèi)壁布滿燈芯狀毛細管結(jié)構(gòu)的腔體，通過一系列的冷凝合蒸發(fā)，Therma-BaseTM高效地傳遞熱量，從而實現(xiàn)整板最大的溫度均一性。Therma-BaseTM核心優(yōu)勢優(yōu)異的空間溫度均一性快速、準確的溫度調(diào)控40個循環(huán)＜40分鐘(384孔板)目前三十三頁\總數(shù)四十頁\編于十九點目前三十四頁\總數(shù)四十頁\編于十九點先進獨特的光學系統(tǒng)

LC480系統(tǒng)使用寬光譜、高強度的氙燈作為光源。激發(fā)光經(jīng)過多次反射后形成與孔板大小相同、光強均一的光柱，有效消除邊緣效應。激發(fā)波長和發(fā)射波長的任意組合，使得多種熒光染料和檢測模式可用于目前所有的實時熒光定量PCR實驗。LC480光學系統(tǒng)的核心優(yōu)勢：

－最靈活地選擇熒光染料及檢測模式

－整板數(shù)據(jù)的精確捕獲

－強大的多重PCR能力目前三十五頁\總數(shù)四十頁\編于十九點

多檢測通道支持所有的檢測模式

LightCycler?480系統(tǒng)