熒光定量徐歆改

熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱可實(shí)時(shí)反映DNA的擴(kuò)增靈敏度極高，用于準(zhǔn)確定量初始模板數(shù)量既能用于定性，判斷一段DNA序列的有無(wú)，也可用于定量，確定起始DNA拷貝數(shù)目前一頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線熒光定量PCR擴(kuò)增曲線并非標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線，并可分為反應(yīng)早期、指數(shù)期和線性期和平臺(tái)期。即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，保證各種條件基本一致，最后得到的DNA拷貝數(shù)也有所不同PCR結(jié)束后的DNA產(chǎn)物量不能反映起始模板量的真實(shí)情況同一樣品盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，但指數(shù)期產(chǎn)物量相同目前二頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），熒光信號(hào)之后進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段。軟件自動(dòng)給出，無(wú)需手動(dòng)設(shè)置。熒光域值（Threshold）為3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍（或本底的2倍）。軟件自動(dòng)給出，可手動(dòng)設(shè)置。Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到熒光域值時(shí)所需的循環(huán)數(shù)。熒光域值與Ct值目前三頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)Ct值與DNA模板每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)目前四頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)非特異性熒光標(biāo)記SYBRGreenI常用熒光標(biāo)記方法特異性熒光標(biāo)記TaqManProbe目前五頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)游離狀態(tài)熒光很弱，但與DNA雙鏈結(jié)合后熒光強(qiáng)度增加1000倍！其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子（即PCR產(chǎn)物）的數(shù)量SYBRGreenI染料法目前六頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)SYBRGreenI染料法缺點(diǎn)：能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，但通過熔解曲線（meltingcurve）的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件加以解決。對(duì)引物特異性要求高（關(guān)鍵）不能進(jìn)行多重定量，增加模板使用量?jī)?yōu)點(diǎn)：對(duì)DNA模板沒有選擇性，適用于任何DNA使用方便，無(wú)需設(shè)計(jì)復(fù)雜探針，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便成本低目前七頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)熔解曲線分析引物二聚體PrimerdimersProductofInterest目前八頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)5’端標(biāo)記有報(bào)告基因（Reporter，R），如FAM、VIC等3’端標(biāo)記有熒光淬滅集團(tuán)（Quencher，Q）探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無(wú)熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan探針法每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步目前九頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)TaqMan探針法熒光標(biāo)記物的選擇目前十頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)不同定量方法的比較目前十一頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)絕對(duì)定量：指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知的樣本的量，絕對(duì)定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度相對(duì)定量：在一定樣本中靶序列相對(duì)于另一參照樣本的量的變化，相對(duì)定量常見于比較兩個(gè)樣本中基因表達(dá)水平的高低變化定量方法目前十二頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)絕對(duì)定量目前十三頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)拷貝數(shù)的計(jì)算樣品DNA濃度（ng/μl）=OD260×40×稀釋倍數(shù)樣品分子量=質(zhì)粒堿基對(duì)總數(shù)×660拷貝數(shù)（copies/μl）=樣品DNA濃度/樣品分子量×6.02×1014倍比梯度稀釋方法梯度1：原液（106copies/μl）梯度2：1份原液+9份稀釋緩沖液，105copies/μl梯度3：1份梯度2溶液+9份稀釋緩沖液，104copies/μl梯度4：1份梯度3溶液+9份稀釋緩沖液，103copies/μl梯度5：1份梯度4溶液+9份稀釋緩沖液，102copies/μl梯度6：1份梯度5溶液+9份稀釋緩沖液，10

copies/μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計(jì)算目前十四頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)以不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行定量PCR并獲得對(duì)應(yīng)的CT，即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制目前十五頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以lg（CT）為縱坐標(biāo)，lg（拷貝數(shù)）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率（E）=（10-1/斜率-1）×100%相關(guān)系數(shù)（R2）應(yīng)大于0.99，越接近1越好E應(yīng)介于95%與105%，越接近100%越好目前十六頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算將未知樣品的CT值（y）代入線性方程求得對(duì)應(yīng)的x未知樣品的拷貝數(shù)=10x目前十七頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)管家（內(nèi)參）基因：維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因，不隨外界刺激發(fā)生變化或變化不大常用的有：beta-actin，GAPDH，18SrRNA等原理：以管家基因的表達(dá)量為參照，定量目的基因的表達(dá)量前提：管家基因與目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率相似且接近100%方法：2-△△CT（Livak）法用管家基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：△CT＝目標(biāo)基因的CT－管家基因的CT

用對(duì)照組的△CT值歸一處理組的△CT值：△△CT＝處理組△CT－對(duì)照組△CT相對(duì)表達(dá)水平比率=2-△△CT（對(duì)照組為1）相對(duì)定量目前十八頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)?CtSample?CtNontreatedsampleHousekeepingGene?Ct?Ct??

Ct2-??

Ct

=ChangeinExpressionLevelGeneofInterest相對(duì)定量目前十九頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)PCR反應(yīng)體系以TAKARASYBR?

PremixEx

TaqTMII為例試劑使用量終濃度SYBRPremixEx-Taq(2×)10μL1×PCRForwardPrimer(10μm)0.8μL0.4μmPCRReversePrimer(10μm)0.8μL0.4μmROXReferenceDye(50×)0.41×DNA模板2μLdH2O6μLTotal20μL目前二十頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)ABI7500Real-TimePCR System目前二十一頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)程序的設(shè)置（相對(duì)定量）背參染料的熒光強(qiáng)度不隨PCR反應(yīng)變化，用于校正孔與孔之間的熒光干擾或反應(yīng)體積變化對(duì)SYBR?GREEN熒光強(qiáng)度的影響目前二十二頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序染料法的熒光采集step在每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增step后目前二十三頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)結(jié)果的查看目前二十四頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)數(shù)據(jù)的導(dǎo)出目前二十五頁(yè)\總數(shù)二十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)引物的設(shè)計(jì)NCBIGen