EB病毒檢測技術(shù)進展及臨床應(yīng)用

概述Epstein-Barr病毒（EBV）皰疹病毒科，γ亞科，嗜淋巴細(xì)胞病毒屬，1964年由Epstein、Barr等人首次在非洲兒童的惡性淋巴瘤組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)。EBV是是傳染性單核細(xì)胞增多癥的病原體，也是一種重要的腫瘤相關(guān)病毒，與鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖癥等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，被列為致癌性病毒之一。目前一頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點概述傳播途徑：EBV感染主要通過唾液接觸傳播，也可通過血液傳播；人感染EBV后建立終身潛伏感染，人群感染率超過90%。1-6歲兒童、14-20歲青少年及年輕成年人高度易感，發(fā)展中國家EBV感染多發(fā)生在兒童早期。目前二頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點病原學(xué)皰疹病毒科，γ皰疹病毒亞科，淋巴隱病毒屬，人皰疹病毒4型球形雙鏈DNA病毒，基因組平均大小約為172kb目前三頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點目前四頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點目前五頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV致病機制原發(fā)EBV感染時，EBV先是在口咽部上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，然后感染附近的B淋巴細(xì)胞，受到感染的B淋巴細(xì)胞進入血液循環(huán)可以造成全身性感染。EBV原發(fā)感染后，大多數(shù)無臨床癥狀，尤其是6歲以下幼兒大多表現(xiàn)為隱性或輕型發(fā)病，但在兒童期、青春期和青年期，約50%的原發(fā)性感染均表現(xiàn)為IM。目前六頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV在人體B細(xì)胞建立潛伏感染，EBV只表達潛伏抗原（包括EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2及EBER），受感染者將成為終身帶毒者。在機體免疫功能下降和某些因素觸發(fā)下，潛伏的EBV可以被再激活，引起病毒復(fù)制及臨床疾病。EBV致病機制目前七頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV常見相關(guān)疾病傳染性單核細(xì)胞增多癥

（Infectiousmononucleosis,IM)慢性活動性EB病毒感染

（ChronicactiveEBVinfection，CAEBV）EB病毒相關(guān)性嗜血細(xì)胞綜合征

（EBV-associatedhemophagocyticsyndrome,EBVAHS)Burkitts淋巴瘤何奇金淋巴瘤目前八頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV感染的抗原表達EBV溶解性感染期，可表達：早期抗原（EA）：EA/R和EA/D（具DNA多聚酶活性）；

EA出現(xiàn)表明EBV活躍增殖，EA抗體出現(xiàn)在感染早期；衣殼蛋白（VCA）晚期表達的結(jié)構(gòu)蛋白VCA-IgM出現(xiàn)在急性感染早期，VCA-IgG出現(xiàn)在急性感染期并持續(xù)存在膜抗原（MA）：細(xì)胞表面包膜糖蛋白（MAgp350/220,gp85)，是EBV的中和性抗原抗MA-IgM可用于早期診斷目前九頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV潛伏感染期，選擇性表達早期抗原以及：

核抗原（EBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3C）：為DNA結(jié)合蛋白，在感染的B細(xì)胞核內(nèi)；EBNA-1與感染有關(guān)，EBNA-2與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和永生化有關(guān)；EBNA抗體出現(xiàn)在感染晚期。

潛伏膜蛋白（LMP-1,-2A,-2B）：在感染B細(xì)胞表面，與細(xì)胞惡化有關(guān)，

未翻譯的轉(zhuǎn)錄物BARF0和EBER

EBNA-3、EBNA-2、LMP-1是EBV-CTLCD8+的主要目標(biāo)EBV感染的抗原表達目前十頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點原發(fā)性EBV感染過程中首先產(chǎn)生針對衣殼抗原（capsidantigen,VCA）IgG和IgM，在急性感染的晚期，抗早期抗原（earlyantigen,EA）抗體出現(xiàn)在恢復(fù)期晚期，抗核抗原（nuclearantigen,NA）抗體產(chǎn)生，抗VCA-IgG和抗NA-IgG可持續(xù)終身目前十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV感染的血清學(xué)診斷目前十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點傳統(tǒng)檢測策略的問題5%新近EBV感染不出現(xiàn)CA-IgM抗體在罕見的病例中抗CA-IgM會持續(xù)存在約20-30%的新近感染不出現(xiàn)EA-IgG抗體抗EBNA-IgG抗體可能呈現(xiàn)陰性，由于：-慢性活動性EBV感染-細(xì)胞免疫被抑制目前十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV感染的血清學(xué)診斷抗VCA-IgM和IgG可以同時出現(xiàn)，通常IgG出現(xiàn)較IgM晚，但偶爾較IgM出現(xiàn)早1~2周，抗VCA-IgM幾周后檢測不到抗EA-IgG在發(fā)病后3-4周后升高，3~4月后檢測不到抗EBNA-1-IgG在發(fā)病后3~4周被檢測到，持續(xù)終身，部分慢性EBV感染者檢測不到抗VCA-IgG和抗EBNA-1-IgG終生持續(xù)陽性目前十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV常見相關(guān)疾病目前十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)

infectiousmononucleosis特指由EBV感染引起的發(fā)熱、咽炎和淋巴結(jié)腫大的綜合征1889年被首次描述為“glandularfever”1920年正式定義為IM1932年發(fā)現(xiàn)嗜異性凝集實驗1968年實驗室工作人員感染EBV，出現(xiàn)IM臨床癥狀和嗜異性凝集抗體，明確EBV是IM的病原目前十六頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點IM臨床表現(xiàn)

25-30%的青少年和<30歲的成年人原發(fā)感染EBV后表現(xiàn)IM兒童時期EBV感染多為亞臨床型或不典型癥狀臨床癥狀：發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、扁桃體炎（灰白色滲出）、咽炎、肝脾腫大、眼瞼水腫和皮疹、上腭粘膜出血點皮疹經(jīng)常發(fā)生于使用氨芐西林、阿莫西林和一些β內(nèi)酰胺類抗生素1周后，發(fā)生率90%并發(fā)癥：粒細(xì)胞減少、血小板減少、脾破裂、扁桃體肥大致氣道阻塞、暴發(fā)性肝炎、溶血性貧血、再生障礙性貧血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病目前十七頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點目前十八頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點慢性活動性EBV感染,CAEBV

chronicactiveEBVinfection

1975年Horwitz首次描述一些持續(xù)性IM患者血清存在高滴度的抗EBV-VCA和EA抗體1982年Tobi進一步描述并證實該病1984年被稱為慢性單核細(xì)胞增多樣綜合征1986年被定義為慢性癥狀性EBV感染1991年被稱為慢性活動性EBV感染目前十九頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點CAEBV發(fā)生于兒童或年輕成年人該病表現(xiàn)為慢性或反復(fù)的單核細(xì)胞增多樣癥：發(fā)熱、肝脾腫大、持續(xù)性肝炎、廣泛性淋巴結(jié)腫大EBV感染的NK和T細(xì)胞克隆擴增在CAEBV具有重要意義通常是一種腫瘤前狀態(tài)或者與嚴(yán)重免疫缺陷有關(guān)，可進一步引起EBV相關(guān)的T/NK細(xì)胞增殖性疾病預(yù)后差，病死率高目前二十頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點CAEBV的診斷標(biāo)準(zhǔn)1）持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作的IM樣癥狀2）異常升高的抗VCA-IgG和EA-IgG

和/或受累組織包括外周血檢測到EBV基因組3）慢性疾病不能以其他已知的疾病解釋

OkanaM,etal.ProposedguidelinesfordiagnosingchronicactiveEpstein-Barrvirusinfection.AmericaJHematol.2005,80:64-69目前二十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點Hydroavacciniforme

牛痘樣水皰

hypersensitivitytomosquitobites目前二十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點CAEBV的診斷標(biāo)準(zhǔn)(1)臨床癥狀持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作的IM樣癥狀發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大并發(fā)癥：血液系統(tǒng)（EBV-HLH、淋巴瘤、白血病、DIC、血小板減少、貧血）消化系統(tǒng)（肝功能衰竭、消化道潰瘍）中樞神經(jīng)系統(tǒng)間質(zhì)性肺炎心血管（冠狀動脈瘤、心肌炎、心瓣膜?。┢つw（蚊蟲叮咬過敏、皮膚牛痘樣水皰）目前二十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點CAEBV的診斷標(biāo)準(zhǔn)(2)血清抗體滴度異常升高抗VCA-IgG≥1:640和抗EA-IgG≥1:160抗VCA-IgA和/或抗EA-IgA常呈陽性受累組織和外周血檢測到EBV-DNA、RNA、有關(guān)抗原和克隆PCR：外周血PBMC中EBV-DNA定量>102.5copies/μg原位雜交：檢測出EBER-1陽性細(xì)胞Southern雜交：受累組織或外周血中檢測出EBVDNA免疫熒光：檢測到抗原（EBNA、LMP）感染的B、T、NK細(xì)胞、單核/巨噬/組織細(xì)胞檢測到EBNA、EBER、EBV-DNA目前二十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV相關(guān)的噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥

EBV-associatedhemophagocyticlymphohistocytosisEBV-HLH

是一種與EBV感染有關(guān)的淋巴增殖伴隨吞噬血細(xì)胞現(xiàn)象的一類疾病EBV感染所致CD8+T細(xì)胞的異常增殖及其激活巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子大量釋放產(chǎn)生高細(xì)胞因子血癥（細(xì)胞因子風(fēng)暴）是EBV-HLH的主要病例生理特征臨床表現(xiàn)發(fā)熱、肝脾腫大、黃疸、全血細(xì)胞減少、DIC，骨髓和其他組織見嗜血細(xì)胞、LDH、鐵蛋白、β微球蛋白EBV-HLH常見于兒童和青少年目前二十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點抗EBV病毒藥物無環(huán)核苷擬似劑acyclovir（阿昔洛韋），ED500.3μΜganciclovir（更昔洛韋），ED500.05μΜvalaciclovir（纈昔洛韋）無環(huán)核苷酸cidofovir，adefovir焦磷酸鹽擬似劑

foscarnet（磷甲酸鈉）作用機制作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒復(fù)制目前二十六頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV感染的實驗室診斷外周血分類淋巴細(xì)胞≥50%WBC不典型淋巴細(xì)胞≥10%WBC（系激活的CD8+CTL）血清學(xué)檢查嗜異性凝集實驗（heterophiletest/spottest）VCA-IgM、IgG，EA-IgG，EBNA-IgG病毒學(xué)標(biāo)志在PBMC、血清、全血或感染組織檢測EBV-DNA、EBER、EBNA、LMP目前二十七頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV感染疾病的血清學(xué)診斷診斷VCAIgMVCAIgGEAIgGEBNAIgG既往無感染－－－－IM(急性期)＋＋＋－IM（恢復(fù)期）＋/－＋＋/－＋/－既往感染－＋低＋/－＋慢性活動性感染＋/－高＋高＋＋/－目前二十八頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點臨床需要回答的問題是否感染EBV?EBV感染的時相？是否EBV活動性感染？疾病是否與EBV感染相關(guān)？目前二十九頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV實驗室檢測方法

病毒培養(yǎng)免疫學(xué)技術(shù)（免疫熒光法，免疫組化技術(shù)）

血清學(xué)方法（ELISA法，化學(xué)發(fā)光法）

基因診斷技術(shù)目前三十頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點

嗜異凝集抗體試驗：也稱“Monospot”試驗。在EBV還未確定為IM的病因之前，1932年引入臨床實踐診斷IM。當(dāng)時發(fā)現(xiàn)IM患者的血清或血漿可以凝集馬或綿羊的紅細(xì)胞。該抗體在病程第1～2周出現(xiàn)，持續(xù)約6個月。在青少年原發(fā)性EBV感染中其陽性率可達80％-90％，約10％的青少年缺乏對嗜異性抗體的陽性反應(yīng)。EBV實驗室檢測方法目前三十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV感染的血清學(xué)診斷評價嗜異性抗體（heterophileantibody，HA）凝集實驗（“spot”test）嗜異性抗體（IgM）在發(fā)病后7天內(nèi)出現(xiàn)，2-5周達高峰，可以持續(xù)6-12個月，偶有12個月后以低水平存在HA陽性提示原發(fā)急性感染，EBV再激活感染幾乎陰性陽性率：青少年和成年人71%-90%，2-5歲兒童50%假陰性：發(fā)病第1周內(nèi)假陰性率25%，10%成人始終陰性假陽性：2-3%自身免疫性疾病、HIV感染、心內(nèi)膜炎、HAV肝炎目前三十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點缺點需要硬件設(shè)備成本昂貴優(yōu)點敏感性高特異性強操作簡便化學(xué)發(fā)光技術(shù)目前三十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點膠體金是氯金酸HAuCl4的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)簡便，快捷，敏感度和特異度較差目前三十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBERS原位雜交試驗EBV潛伏感染的細(xì)胞含有大量的EBERl／EBER2（EBERS）轉(zhuǎn)錄子，其主要功能是抑制干擾素介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)和凋亡。該轉(zhuǎn)錄子不翻譯成蛋白質(zhì)，每個EBV潛伏感染的細(xì)胞含有大約106拷貝EBERS，被認(rèn)為EBV潛伏感染的最好標(biāo)志物，因此原位雜交檢測腫瘤細(xì)胞中EBERS是診斷腫瘤是否EBV相關(guān)的金標(biāo)準(zhǔn)EBV實驗室檢測方法目前三十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV病毒核酸檢測實時熒光定量PCR是目前最主要的監(jiān)測EBV載量的方法鑒別EBV健康攜帶者的低水平復(fù)制與EBV相關(guān)疾病患者高水平活動性感染。目前三十六頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點EBV載量檢測有多種方法，Real-timePCR是目前最主要的監(jiān)測EBV載量的方法，有較強的敏感性和特異性。不同的EBV疾病進行Real-timePCR檢測時，需要的標(biāo)本不同。EBV病毒核酸檢測目前三十七頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點疾病感染細(xì)胞感染方式檢測病毒定量的最合適標(biāo)本血漿/血清單核細(xì)胞全血傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM）B細(xì)胞漿細(xì)胞溶解性感染潛伏Ⅲ理想√不推薦不推薦移植后淋巴增殖性疾?。≒TLD）B細(xì)胞潛伏Ⅲ理想最合適√慢性活動性EBV感染（CAEBV）T細(xì)胞NK細(xì)胞潛伏Ⅱ評價預(yù)后適合診斷√EBV相關(guān)性疾病的病毒DNA定量檢測血清游離的EBV-DNA提示原發(fā)感染或者再激活健康攜帶者血清EBV-DNA通常檢測不到目前三十八頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點目前三十九頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點目前四十頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點目前四十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點傳單的EBV感染實驗室診斷血清學(xué)檢測：同時滿足下列2條者可以診斷為EBV-IM:1.下列臨床癥狀中的3項：發(fā)熱、咽峽炎、頸淋巴結(jié)腫大、肝腫大、脾腫大；2.原發(fā)性EBV感染的血清學(xué)證據(jù)，滿足下列2條中任一項：（1）抗EBV-CA-IgM和抗EBV-CA-IgG陽性，且抗EBV-NA-IgG陰性（2）抗EBV-CA-IgM陰性，但抗EBV-CA-IgG陽性，且為低親和力抗體目前四十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點傳單的EBV感染實驗室診斷DNA檢測？:IM患者外周血中EB病毒載體在2周內(nèi)達到峰值，隨后很快下降。至病程14天，多數(shù)EBV-IM患者血清中已檢測不到病毒核酸，病程22天后，所有EBV-IM患者血清中均檢測不到病毒核酸。IM患者不推薦進行EB病毒載量檢測目前四十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點慢性活動性EBV感染的實驗室診斷EBV抗體檢測抗體反應(yīng)類型EBV抗體比例（%）CA-IgGCA-IgMEA-IgGNA-IgG1+-++54.92+-+-25.53++++5.94+++-5.95+--+3.96+---3.9目前四十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十二點慢性活動性EBV感染的實驗室診斷