淺談分光光度計(jì)的精度暨驗(yàn)證

淺談分光光度計(jì)的精度暨驗(yàn)證PerkinElmer上海孫明分子光譜儀中的紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)和傅立葉變換紅外光譜儀都是很常用的分析儀器，對(duì)于這兩種儀器，通常我們應(yīng)該非常關(guān)注儀器的橫坐標(biāo)精度和縱坐標(biāo)精度這兩個(gè)性能，因?yàn)槲覀兊臏y(cè)定結(jié)果就是以橫坐標(biāo)波長(zhǎng)和縱坐標(biāo)吸光度(或透過(guò)率)這兩個(gè)參數(shù)的組合來(lái)表示的。如果橫坐標(biāo)不準(zhǔn)或者縱坐標(biāo)不準(zhǔn)，測(cè)試的結(jié)果就會(huì)有問(wèn)題了。那么我們?cè)隍?yàn)收或日常操作使用中如何評(píng)估和檢驗(yàn)這兩個(gè)指標(biāo)呢？校驗(yàn)儀器的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度和吸光度準(zhǔn)確度最基礎(chǔ)也是最好的方法就是找一個(gè)已知吸光度準(zhǔn)確值和/或波長(zhǎng)準(zhǔn)確值的標(biāo)樣(基準(zhǔn)物)，用待校驗(yàn)的儀器去測(cè)定該標(biāo)樣，把測(cè)定的結(jié)果和已知的值對(duì)比，看相符合的程度。基準(zhǔn)物是不是能方便地獲得和使用以及所能夠達(dá)到的準(zhǔn)確度水平是不一樣的。最好的基準(zhǔn)物是物質(zhì)的基本性質(zhì)，比如氘燈或汞燈的發(fā)射譜線，常用作紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)的橫坐標(biāo)基準(zhǔn)。另一類基準(zhǔn)物是一些已經(jīng)準(zhǔn)確研究測(cè)定其性質(zhì)的固體物，如聚苯乙烯薄膜，常用作傅立葉變換紅外光譜儀的橫坐標(biāo)基準(zhǔn)；欽玻璃(氧化欽玻璃)，常用作紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)的橫坐標(biāo)基準(zhǔn)。由權(quán)威機(jī)構(gòu)標(biāo)定的基準(zhǔn)物就稱為相應(yīng)的基準(zhǔn)，比如NIST標(biāo)定的聚苯乙烯薄膜標(biāo)樣就稱為NIST的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。除此以外，一些已知吸光度準(zhǔn)確值的一定濃度的液體標(biāo)樣也常用作基準(zhǔn)物，如用于測(cè)定吸光度的重銘酸鉀等?，F(xiàn)在的問(wèn)題是我們通常在儀器的性能指標(biāo)里所看到的橫坐標(biāo)精度和縱坐標(biāo)精度是不是就是波長(zhǎng)準(zhǔn)確度和吸光度準(zhǔn)確度這兩個(gè)指標(biāo)呢？不一定！實(shí)際上我們可能涉及到的是四個(gè)指標(biāo)，而且由于翻譯或人為的原因，在目前一般的儀器性能指標(biāo)的表述中這四個(gè)指標(biāo)的名稱和含義還可能各不相同。這造成很多人在選型和使用中的困惑。我們所說(shuō)的橫坐標(biāo)精度和縱坐標(biāo)精度實(shí)際上可能是下列的準(zhǔn)確度或精密度指標(biāo)：波長(zhǎng)準(zhǔn)確度(WavelengthAccuracy)波長(zhǎng)精密度(WavelengthPrecision)吸光度準(zhǔn)確度(AbsorbanceAccuracy)吸光度精密度(AbsorbancePrecision)實(shí)際上準(zhǔn)確度和精密度是兩個(gè)不同的概念，我們可以對(duì)照我們?nèi)粘Ｊ褂玫某邅?lái)闡述一下：如圖有兩把直尺，一把是普通的文具尺，另一把是工程師用的鋼直尺。哪一把更精密呢？鋼直尺有更精細(xì)的刻線，允許做更精細(xì)的測(cè)量，甚至可以^【J0.25mm。相比于那把最小只有1mm刻度的塑料尺，它是更精密的測(cè)量工具。另一方面，哪一把尺更精確些呢？我們來(lái)看看尺上刻的其他標(biāo)記:在鋼直尺上刻著：“在20°C標(biāo)定”，這意味著這把尺在這個(gè)溫度時(shí)是最準(zhǔn)確的(在這個(gè)溫度時(shí)它測(cè)量的結(jié)果最接近真實(shí)的長(zhǎng)度)。所以我們敢斷定鋼直尺在常溫時(shí)通常是更準(zhǔn)確的。但是不要忘記兩把尺的準(zhǔn)確度都在變化，特別是隨著溫度變化。當(dāng)溫度升高時(shí)它們會(huì)延伸，當(dāng)溫度下降時(shí)它們會(huì)收縮。因?yàn)檫@兩把尺是用不同的材料制造的，在溫度變化時(shí)它們伸縮的效果會(huì)不同，在某些時(shí)候比如低溫時(shí)，塑料尺甚至可以比鋼直尺更準(zhǔn)確。搞糊涂了嗎？讀一讀下面的定義吧:精密度（Precision）:一個(gè)測(cè)量一致地重復(fù)的能力?；蛘咭粋€(gè)值可靠地測(cè)量時(shí)的有效數(shù)字的位數(shù)。準(zhǔn)確度（Accuracy）:一個(gè)測(cè)量的值與真值匹配的能力。請(qǐng)注意，精密度本身就包含了兩種定義，一個(gè)是測(cè)量的重復(fù)性，而另一個(gè)是測(cè)量的有效數(shù)字的位數(shù)。而后一個(gè)定義太容易忽悠人了。人們似乎往往忽略了可靠地測(cè)量這幾個(gè)字的意思。在紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)的指標(biāo)中，波長(zhǎng)準(zhǔn)確度和精密度常常用波長(zhǎng)準(zhǔn)確度和波長(zhǎng)重復(fù)性來(lái)表示。如果一臺(tái)紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)的指標(biāo)分別是：波長(zhǎng)準(zhǔn)確度 優(yōu)于土0.1nm波長(zhǎng)重復(fù)性 優(yōu)于土0.05nm那么在采用氘燈656.1nm的發(fā)射譜線作為基準(zhǔn)時(shí)，波長(zhǎng)準(zhǔn)確度優(yōu)于土0.1nm的意思就是儀器對(duì)氘燈656.1nm譜線的測(cè)量值會(huì)落在在656.0nm?656.2nm之間；而波長(zhǎng)重復(fù)性優(yōu)于土0.05nm的意思是重復(fù)測(cè)量656.1nm譜線十次，其平均偏差小于土0.05nm。由于使用了波長(zhǎng)準(zhǔn)確度和波長(zhǎng)重復(fù)性這樣準(zhǔn)確的描述，一般不會(huì)弄錯(cuò)。對(duì)比這兩個(gè)指標(biāo)我們還發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)數(shù)據(jù)雖然含義不一樣，但在數(shù)值上還是很接近的，實(shí)際上好的重復(fù)性（精密度）是好的準(zhǔn)確度的基礎(chǔ)。偶爾也可以看到有些儀器標(biāo)示的是“波長(zhǎng)精度”指標(biāo)，通常是說(shuō)可以顯示幾位有效數(shù)字的精密度，多半已經(jīng)有些忽悠人的味道了。但是對(duì)傅立葉變換紅外光譜儀來(lái)說(shuō)，事情變得有點(diǎn)復(fù)雜了。傅立葉變換紅外光譜儀通常給出的只是“波長(zhǎng)精度”指標(biāo)，甚而什么都不給。而“波長(zhǎng)精度”又幾乎無(wú)一例外地是0.01cm-1，這是因?yàn)楦盗⑷~變換紅外光譜儀通常使用氦氖激光來(lái)作波長(zhǎng)校正的，或者簡(jiǎn)單說(shuō)傅立葉變換紅外光譜儀是用激光的波長(zhǎng)來(lái)做橫坐標(biāo)的刻度的，所以精密度（有效數(shù)字的位數(shù)）自然就很好而且很一致，但它是用有效數(shù)字的位數(shù)表示的精密度而不是波長(zhǎng)準(zhǔn)確度指標(biāo)，更糟糕的是這個(gè)值還是無(wú)法驗(yàn)證的，它只是一個(gè)最小分度值而已。那么可以驗(yàn)證的指標(biāo)是什么呢？當(dāng)然是波長(zhǎng)準(zhǔn)確度了。對(duì)于傅立葉變換紅外光譜儀的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度，我們通常用0.04mm左右的聚苯乙烯薄膜作橫坐標(biāo)基準(zhǔn)來(lái)標(biāo)定，校驗(yàn)時(shí)常用到的峰值有：3060cm-12851cm-11601.3cm-11583.0cm-11028.3cm-1907cm-1假如我們購(gòu)買了NIST的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)附帶的證書(shū)上會(huì)給出若十個(gè)不同位置的峰的峰值和不確定度，NIST聚苯乙烯膜的峰值不確定度通常是土0.3cm-1。這樣，在校驗(yàn)時(shí)最好的情況下是儀器的測(cè)量值都落在標(biāo)準(zhǔn)物的偏差范圍內(nèi)，此時(shí)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度等于標(biāo)準(zhǔn)的偏差即土0.3cm-1。如果希望儀器的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度達(dá)到與儀器的波長(zhǎng)精密度相當(dāng)?shù)乃?，也就?.01cm-1的水平，你必須使用更準(zhǔn)確的標(biāo)樣來(lái)標(biāo)定儀器，比如說(shuō)使用已知峰值準(zhǔn)確到小數(shù)點(diǎn)以后第二位的（偏差0.01cm-i）氣體標(biāo)樣來(lái)標(biāo)定。一般情況下，傅立葉變換紅外光譜儀的測(cè)量值離標(biāo)準(zhǔn)物的偏差范圍一定的范圍內(nèi)都算合格，我們通常按±2cm-1來(lái)驗(yàn)收，比如對(duì)于3060±0.3cm-1，測(cè)量值為3061cm-1，儀器的橫坐標(biāo)準(zhǔn)確度近似為±1cm-1。也就是說(shuō)傅立葉變換紅外光譜儀的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度要遠(yuǎn)差于波長(zhǎng)精密度指標(biāo)，同時(shí)，0.01cm-1這個(gè)精密度指標(biāo)還不等同于重復(fù)性指標(biāo)，拿一片標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯薄膜在同樣條件下間隔10分鐘重復(fù)做10次測(cè)量，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)你的傅立葉變換紅外光譜儀的波長(zhǎng)重復(fù)性對(duì)于不同的峰通常會(huì)在0.01cm-1到0.1cm-/間，有時(shí)甚至更差。綜上所述，由于傅立葉變換紅外光譜儀的波長(zhǎng)精密度相對(duì)于波長(zhǎng)準(zhǔn)確度來(lái)說(shuō)要好得多，所以傅立葉變換紅外光譜儀的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度主要取決于標(biāo)定時(shí)采用的標(biāo)準(zhǔn)，然而如果測(cè)試的儀器質(zhì)量較差致使儀器的波長(zhǎng)重復(fù)性較差的話，則將主要取決于標(biāo)定儀器的波長(zhǎng)重復(fù)性。那么這些在紅外光譜里有什么意義呢？精密度是我們使用同一個(gè)光譜儀在同樣條件下進(jìn)行同樣的測(cè)試時(shí)獲得結(jié)果的一致性的尺度。準(zhǔn)確度反映了不同的光譜儀測(cè)量時(shí)與真值符合的有多好。好的準(zhǔn)確度是比較從不同的光譜儀獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量的價(jià)值中樞。對(duì)于傅立葉變換紅外光譜儀來(lái)說(shuō)，比較容易獲得好的波長(zhǎng)精密度（短期重現(xiàn)性），而較難獲得好的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度（長(zhǎng)期的重現(xiàn)性，或者儀器與儀器之間與真值匹配的程度）。這是因?yàn)楦道锶~變換紅外使用激光來(lái)作波長(zhǎng)校正，所以精密度天然就很好。然而，降低準(zhǔn)確度的效應(yīng)就很多，比如：激光以某一角度透過(guò)干涉儀，而紅外光束要比激光發(fā)散得多，并且紅外光束可能由于樣品位置影響和光束偏轉(zhuǎn)的影響。所以，不要被搞糊涂。很容易在刻度尺上加更多的刻度，也很容易在吸