CCK-8操作說明與檢測步驟

DOJINDO操作說明細胞活性檢測1.在96孔板中接種細胞懸液(100ml/孔)。將培育板放在培育箱預(yù)培育(在37℃，5%CO2的條件下)。2.向每孔加入10ml的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D值的讀數(shù))。3.將培育板在培育箱內(nèi)孵育1-4小時。用酶標儀測定在450nm處的吸光度。5.若是臨時不測定O.D值，打算今后測定的話，能夠向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液也許1%w/vSDS溶液，并掩蓋培育板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。細胞增殖-毒性檢測1.在96孔板中配制100ml的細胞懸液。將培育板在培育箱預(yù)培育24小時(在37℃，5%CO2的條件下)。向培育板加入10ml不同濃度的待測物質(zhì)。3.將培育板在培育箱孵育一段適合的時間(比方:6,12,24或48小時)。4.向每孔加入10mlCCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D值的讀數(shù))。將培育板在培育箱內(nèi)孵育1-4小時。用酶標儀測定在450nm處的吸光度。7.若是臨時不測定O.D值，打算今后測定的話，能夠向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液也許1%w/vSDS溶液，并掩蓋培育板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。注意：若是待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8從前更換新鮮培育基，去掉藥物的影響。自然藥物影響比較小的狀況能夠不更換培育基，直接扣除培育基中加入藥物后的空白吸取即可。制作標準曲線先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)目，爾后接種細胞。2.按比率(比方：1/2比率)挨次用培育基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個復(fù)孔。3.接種后培育2-4小時使細胞貼壁，爾后加CCK-8試劑培育一準時間后測定O.D值，制作出一條以細胞數(shù)目為橫坐標(X軸)，O.D值為縱坐標(Y軸)的標準曲線。依據(jù)此標準曲線能夠測定出未知樣品的細胞數(shù)目(使用此標準曲線的前提條件是實驗的條件要一致，便于確立細胞的接種數(shù)目以及加入CCK-8后的培育時間)。優(yōu)選DOJINDO檢測步驟CCK-8檢測步驟向各孔中加入100μl細胞懸液。a)在37℃下預(yù)孵育培育板。b)向各孔中加入各濃度的待測溶液c)10μl。37℃下孵育。向各孔中加入10μl的CCK-8溶液d)。37℃下孵育1-4小時。e)測定450nm處的OD值。使用適合的培育基制備50,000-100,000個/ml的細胞懸液。建議使用CO2培育箱過夜預(yù)培育。使用培育基或PBS來制備溶液。d)若是待測溶液有還原性，測定不含細胞，但含有CCK-8的待測溶液在450nm處的空白吸光度。若是該吸光度很小，則能夠直接加入CCK-8，若是吸光度相對較大，則需要除去培育基，并用培育基沖洗細胞兩次，爾后加入新的100μl培育基和10μlCCK-8進行檢測。白細胞可能需要培育較長時間?；盍τ嬎慵毎盍?（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100A（加藥）：擁有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度A（空白）：擁有培育基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度A（0加藥）：擁有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力問答：1.一個孔中應(yīng)接種多少個細胞？當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量最少為1,000個/孔(100μl培育基)。檢測白細胞時的矯捷度相對較低，所以介紹接種量不低于2,500個/孔(100μl培育基)。若是要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并依據(jù)每孔培育基整體積的10%加入CCK-8溶液。2.可否用384孔板進行試驗？能夠。向各孔中加入培育基體積10%的CCK-8溶液，若是加入的CCK-8體積太少，能夠先將CCK-8溶液稀釋1倍，爾后加入培育基體積20%的量。3.可否用24孔板進行試驗？優(yōu)選能夠。向各孔中加入培育基體積10%的CCK-8溶液。4.酚紅會影響檢測嗎？不會。培育基中酚紅的吸光度能夠在計算時，經(jīng)過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，所以不會對檢測造成影響。5.CCK-8與胸苷結(jié)合檢測之間可否有相關(guān)性？有。但是，請注意因為CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，所以結(jié)果可能不同。6.CCK-8可否檢測細菌細胞？能夠檢測E.coli，但不能夠檢測酵母細胞。向100μlE.coli培育液中加入10μlCCK-8溶液，并培育1-4個小時或過夜。7.CCK-8牢固嗎？CCK-8在0-5℃下能夠保存最少6個月，在-20℃下避光能夠保存1年。若是需要長久保存，我們介紹-20℃的積蓄條件。8.若是沒有450nm的濾光片，還能夠使用哪些其余濾光片？還可使用450nm到490nm之間的濾光片。9.怎樣減少因為CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的偏差？能夠在加樣前用培育基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。10.CCK-8是什么顏色？應(yīng)該是粉紅色。若顏色不同樣，有可能會影響測定。11.CCK8可否對活細胞進行染色？不能夠。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽(WST8)，并經(jīng)過電子載體1MethoxyPMS將活細胞中的電子交換到培育基中的WST8上。因為生成的甲ā也是高度水溶性的，所以CCK8不能夠?qū)毎M行染色。12.CCK8檢測溶液對細胞可否有毒？CCK8溶液自己因為高濃度的1MethoxyPMS的存在而擁有一點毒性。但是，加到培育基中的CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。所以，長時間的培育，如過夜也許培育數(shù)天是可優(yōu)選以的。同一個細胞培育液在CCK8檢測后還能夠用于其余細胞增殖檢測，如結(jié)晶紫檢測，中性紅檢測也許DNA熒光檢測等。因為每種細胞對于CCK8的耐受力都不同，所以在需要進行長時間培育時，先檢測一下細胞在加入CCK8培育后的活力。13.在做加藥實驗時，藥物對測定可否有影響？怎樣解決？有時會有影響。若是藥物擁有還原性，會和CCK8發(fā)生顯色反響，增添吸光度。解決方法：第一要確認藥物可否有吸取，在含有藥物的培育基中加入CCK8，測定450nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培育基(加CCK8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8從前更換培育基，去掉藥物的影響。14.每次測定的數(shù)值不同樣，是什么原由？怎樣解決？可能會有以下幾個原由：1.當在培育箱內(nèi)培育時，培育板最外一圈的孔最簡單干燥揮發(fā)，因為體積不正確而增添偏差。一般狀況下，最外一圈的孔只加培育基，不作為測定孔用。2.有可能會因為CCK8沾在壁上而產(chǎn)生偏差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培育板以幫助混勻。3.每孔的細胞數(shù)目過多或過少。請早先在1,000100,000個/孔范圍內(nèi)探索條件。15.怎樣設(shè)定空白比較？在不含細胞的培育基中加入CCK8，培育必然的時間，測定450nm的吸光度即為空白比較。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應(yīng)試慮藥物的吸取，可在不含細胞，加入藥物的培育基中加入CCK8，培育必然的時間，測定450nm的吸光度作為空白比較。16.哪些物質(zhì)會影響CCK8的測定？當有還原性物質(zhì)存在時會影響CCK8的測定，比方含有維生素C的Glucose等(一般培育基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的狀況下，會增添空白吸取，但不影響測定，扣除空白吸取即可。17.在實驗中吸光度值太高，若是不能夠減少細胞數(shù)目，怎樣解決？能夠縮短加入CCK8后的培育時間。比方：能夠把加入CCK8試劑后的培育時間由2小時縮短為1小時。18.設(shè)定參比波長的目的是什么？一定設(shè)定嗎？不必然要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設(shè)定參比波長的目的是為了拿出因為樣品污濁所帶來的吸取。19.說明書上僅寫了96孔板的測定方法，若是使用24孔板貨12孔板，應(yīng)該加多少許CCK-8試劑？一般狀況下建議加入CCK-8試劑的量是培育基體積的1/10。優(yōu)選20.在CCK-8顯色過程中，怎樣停止反響？有一下幾種方法（96孔板）：1、在顯色反響后，將培育板放置4℃冰箱內(nèi)。2、每孔加10l0.1MHCL溶液。3、每孔加10μl1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反響停止后，應(yīng)在24小時以內(nèi)測定。21.一定預(yù)培育細胞嗎？不必然。若是要向保持細胞的最好狀態(tài)，建議預(yù)培育細胞。若是不做細胞預(yù)培育，細胞內(nèi)的脫氫酶可能會不牢固。也有人不做細胞預(yù)培育，但在做標準曲線和檢測時需要一致檢測條件。22.若是加入的藥物中含有金屬，可否會有影響？金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會控制5%、15%、90%的顯色反響，使矯捷度降級。若是終濃度是10Mm的話，將會100%控制。23.CCK-8試劑的保存條件？在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。若是需要保存較長時間的話，介紹在-20℃下保存。但是CCK-8若屢次解凍和冰凍將會增添空白吸取，進而影響檢測結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。24.預(yù)培育后，更換培育基需要細胞計數(shù)嗎？一般狀況下用胰蛋白酶辦理對數(shù)增添久的細胞，用血球計數(shù)盤計數(shù)，制備成必然濃度的細胞懸液即可。若是想要精美計數(shù)細胞的話，能夠預(yù)培育后取培育基用血球計數(shù)盤進行計數(shù)。25.CCK-8對于不同的細胞，矯捷度可否同樣？不同樣，懸浮細胞與貼壁細胞對照較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培育1-4小時吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，能夠經(jīng)過延長CCK-8的加入時間或增添細胞數(shù)目來解決。26.懸浮細胞和貼壁細胞在數(shù)目上有何差別？懸浮細胞因為染色比較困那，一般需要增添細胞數(shù)目和延長培育時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數(shù)目過大，有時吸光度會高出酶標儀的讀數(shù)。27.應(yīng)該每次做標準曲線嗎？建議每次做。固然細胞是同樣的，但是細胞的狀態(tài)不必然同樣，對于狀態(tài)不同樣的細胞，建議每次做標準曲線。若是試劑的批號不同樣，矯捷度可能會有稍微的差別，對于不同的批號建議分別做標準曲線。優(yōu)選28.有時在藥物作用狀況下，細胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，可否能