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關(guān)于細(xì)胞工程之核移植技術(shù)與動物克隆第1頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月Wilmutetal.1997,Science(1996.6誕生)2第2頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月什么是克隆**?克隆(Clone)***有兩個方面的含義:一是指用無性方式進行無性繁殖的技術(shù)。二是指經(jīng)過無性方式繁殖所得到的后代群體。J.B.S.Haldane,1963,“人類種族在未來二萬年的生物可能性”的演講上采用“克隆

(Clone)”的術(shù)語。Clone起源于希臘文“Klone”,原意是用“嫩枝”或“插條”繁殖。3第3頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月什么是克隆**?克隆的生物范疇分子克?。喝缁蚩寺〖?xì)胞克?。喝珉s交瘤細(xì)胞克隆動物克?。喊ê艘浦布夹g(shù)(核心)卵裂球培養(yǎng)胚胎分割技術(shù)4第4頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月什么是動物克???動物克隆是一種通過核移植過程進行無性繁殖的技術(shù)?;臼侄位虿襟E:1.獲得“供體細(xì)胞的細(xì)胞核”:早期胚胎細(xì)胞、成年體細(xì)胞2.獲得無核卵母細(xì)胞。3.將目標(biāo)細(xì)胞核經(jīng)顯微手術(shù)移植到去核卵母細(xì)胞中4.適當(dāng)?shù)臈l件下,移植卵母細(xì)胞重新發(fā)育成正常胚胎。5.胚胎被移植到適當(dāng)母體中,獲得與供核個體遺傳性狀已知的個體。5第5頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月第1節(jié)核移植技術(shù)6第6頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月核移植技術(shù)就是利用顯微操作技術(shù)將一個細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個細(xì)胞中,或者將兩個細(xì)胞的細(xì)胞核(或細(xì)胞質(zhì))進行交換,從而可能創(chuàng)造無性雜交生物(新品種)的一項技術(shù)。一、核移植技術(shù)***(Nucleartransfer)概念:7第7頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月1.核移植技術(shù)的類型一、核移植技術(shù)(Nucleartransfer)胚胎細(xì)胞核移植干細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植類型8第8頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月1.核移植技術(shù)的類型1.1b胚胎干細(xì)胞核移植

優(yōu)點:91.1a胚胎細(xì)胞核移植優(yōu)點:分化程度低分化潛能大核移植容易成功具有胚胎細(xì)胞上述優(yōu)點體外培養(yǎng)壽命長,培養(yǎng)更方便第9頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月1.2體細(xì)胞核移植特點:1.核移植技術(shù)的類型10核供體為成體體細(xì)胞范例:克隆綿羊“多莉”體細(xì)胞核全能性的恢復(fù)第10頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月1.2體細(xì)胞核移植----克隆綿羊“多莉”1.核移植技術(shù)的類型11第11頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月1.2體細(xì)胞核移植----“多莉”的意義1.核移植技術(shù)的類型促進生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的研究獲得更多的優(yōu)秀動物個體可以復(fù)制生產(chǎn)高價藥物的動物12第12頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月為何是突破性的工作:解決了使供體細(xì)胞與核受體細(xì)胞(去核卵細(xì)胞)同步的方法。解決了用體細(xì)胞做核供體與轉(zhuǎn)基因的問題。13第13頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月克隆羊多莉的重要生物學(xué)意義***:第一,它證明了:14一個已經(jīng)完全分化了的動物體細(xì)胞核仍然保持著當(dāng)初胚胎細(xì)胞的全部遺傳信息分化了的體細(xì)胞具有再分化的全能性(可恢復(fù)發(fā)育過程中失去的全能性)

遺傳物質(zhì)是可逆變化的第14頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月第二,多莉的成功提示:15在培育體細(xì)胞成為核供體之前,利用“基因靶”技術(shù)精確地植入外源目的基因,誘發(fā)核基因的遺傳改變再用選擇技術(shù)準(zhǔn)確地挑選那些含目的基因的細(xì)胞作為核供體,從而生產(chǎn)出基因克隆體。第15頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月第三,多莉羊的誕生標(biāo)記:人類可以對基因進行有規(guī)律地控制而解決更多的問題利用克隆技術(shù)復(fù)制哺乳類動物的最后技術(shù)障礙已被突破,在理論上已成為可能。16第16頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月1.2體細(xì)胞核移植----“多莉”的后續(xù)影響1.核移植技術(shù)的類型產(chǎn)生克隆人的倫理問題促進克隆技術(shù)的變革2002年,時年6歲的多莉因“老齡性”肺部感染而安樂死,再次引發(fā)克隆動物是否“早衰”的爭論17第17頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月2.哺乳動物核移植技術(shù)的主要操作程序****(1)核受體的處理和制備18(3)細(xì)胞核移植(2)核供體的處理和制備(4)重組核的激活(6)核移植胚胎移入代孕母畜(即胚胎移植)(5)重組胚的體外或體內(nèi)培養(yǎng)第18頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月克隆羊多莉產(chǎn)生的技術(shù)流程19第19頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月核受體細(xì)胞選擇:去核卵母細(xì)胞常常作為核移植的受體細(xì)胞。選擇的生物學(xué)依據(jù)(或為何選擇卵細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞):(1)

核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備20在卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)含有某種特定的因子,可以使移植核中所含有的基因表達程序發(fā)生重新排列。使已經(jīng)分化了的細(xì)胞重新回到發(fā)育過程的原點,同受精卵一樣開始個體發(fā)育過程。第20頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月卵母細(xì)胞的來源:用激素對雌體進行超排處理,從輸卵管沖出體內(nèi)成熟的MII

卵母細(xì)胞。從屠宰場收集卵巢,吸出濾泡中的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs),在體外培養(yǎng)成熟后作為受體。冷凍保存的卵母細(xì)胞(1)

核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備21第21頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月卵母細(xì)胞的去核處理:(1)

核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備22

將MII卵母細(xì)胞置于含細(xì)胞松弛素(5-7.5ug/mL)的培養(yǎng)液處理10-20min.

顯微鏡下以持卵管吸住卵母細(xì)胞.以尖端去核針刺穿透明帶,吸出第一極體和極體下1/3胞質(zhì).第22頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月供體細(xì)胞核具備的條件:必須是完整的二倍體,保持有供體動物完整的基因組供體細(xì)胞核必須能夠在受體細(xì)胞質(zhì)的作用下,產(chǎn)生細(xì)胞分化過程的逆轉(zhuǎn),能重新完成從受精到發(fā)育成一個正常動物個體的全過程。(2)核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備23第23頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月供體細(xì)胞類型:胚胎卵裂球細(xì)胞體細(xì)胞胚胎干細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞(2)核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備24第24頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月(3)細(xì)胞核移植胞質(zhì)內(nèi)注射透明帶下注射25胞質(zhì)內(nèi)注射是用一個外徑5~8μm

的注核針吸取供體核后直接注射進卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)把供體細(xì)胞核注射在透明帶與卵母細(xì)胞之間的卵周隙中,核移植后用電刺激進行細(xì)胞融合第25頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月固定針對準(zhǔn)極體部位,將卵母細(xì)胞固定,去核微吸管對準(zhǔn)極體插入透明帶,將極體和部分細(xì)胞質(zhì)吸入吸管中26第26頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月吸管拉出時,細(xì)胞膜被拉長形成一個橋,吸管脫離透明帶,質(zhì)膜被掐斷,擠推出管中的極體和細(xì)胞質(zhì)27第27頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月體外受精卵形成的8細(xì)胞牛胚胎經(jīng)透明質(zhì)酸處理后,分離出8枚分裂球,吸取細(xì)胞核28第28頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月將胚胎細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞的透明帶中29第29頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月(4)激活受精引起的卵母細(xì)胞激活人工的激活激活是胚胎發(fā)育所必需的人工激活:30是通過電刺激、鈣離子載體等方法,使卵母細(xì)胞從MII期中解放出來,并轉(zhuǎn)到“受精”的狀態(tài)瞬時直流電脈沖激活化學(xué)試劑激活:Ca2+載體、乙醇、SrCl2、放線菌酮、離子霉素人工激活的手段:第30頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月(5)重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng)核移植胚的體內(nèi)培養(yǎng):一般植入輸卵管4-7d,發(fā)育到桑椹胚或囊胚,如牛、羊、豬核移植胚的體外培養(yǎng):體外培養(yǎng)基培養(yǎng),發(fā)育到桑椹胚或囊胚,如大鼠、小鼠、兔31第31頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月(6)胚胎移植受體母畜的選擇:皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N移植部位:輸卵管、子宮角移植方法:同期發(fā)情處理常規(guī)法移植32第32頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月第2節(jié)核移植技術(shù)的應(yīng)用33第33頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月二、核移植技術(shù)的應(yīng)用1.制備轉(zhuǎn)基因克隆動物,

進行生物藥物生產(chǎn)2.培育優(yōu)良畜種,擴大良種種群3.開展異種動物克隆,拯救瀕危動物轉(zhuǎn)基因克隆山羊生產(chǎn):抗凝血因子III轉(zhuǎn)基因克隆羊、牛生產(chǎn):a-1-抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因克隆牛生產(chǎn):膠原蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬生產(chǎn):人生長激素培育品系更純的實驗動物培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)畜種培育種間雜交動物,用于育種用兔卵母細(xì)胞獲得大熊貓早期胚胎34第34頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月二、核移植技術(shù)的應(yīng)用4.與干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合,開展治療性克隆治療性克隆***(Therapeuticcloning)利用核移植技術(shù)與轉(zhuǎn)基因和胚胎干細(xì)胞等生物技術(shù)結(jié)合,體外培養(yǎng)所需細(xì)胞、組織器官、以替代或修補患者損傷或患病的細(xì)胞、組織、器官的過程運用舉例:患者體細(xì)胞去核人卵母細(xì)胞重組胚囊胚ES細(xì)胞定向分化多巴胺神經(jīng)元帕金森病胰島細(xì)胞糖尿病肝細(xì)胞肝纖維化CD4+T細(xì)胞艾滋病35第35頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月二、核移植技術(shù)的應(yīng)用5.利用核移植技術(shù),研究生物學(xué)的基本問題細(xì)胞分化基因調(diào)控核質(zhì)關(guān)系基因組印記36第36頁,課件共40頁,創(chuàng)作于2023年2月克隆技術(shù)存在的問題理論問題分化的體細(xì)胞克隆對遺傳物質(zhì)重編程的機理還不清楚

細(xì)胞核內(nèi)關(guān)閉的基因如何重啟表達細(xì)胞如何重新恢復(fù)全能性及過程克隆動物的連續(xù)后代是否會累積突變基因克隆動物是否會記住供體細(xì)胞的年齡克隆過程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問題

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