細(xì)胞工程之核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆

關(guān)于細(xì)胞工程之核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆第1頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Wilmutetal.1997,Science（1996.6誕生）2第2頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月什么是克隆**？克隆(Clone)***有兩個(gè)方面的含義：一是指用無(wú)性方式進(jìn)行無(wú)性繁殖的技術(shù)。二是指經(jīng)過(guò)無(wú)性方式繁殖所得到的后代群體。J.B.S.Haldane，1963，“人類(lèi)種族在未來(lái)二萬(wàn)年的生物可能性”的演講上采用“克隆

(Clone)”的術(shù)語(yǔ)。Clone起源于希臘文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插條”繁殖。3第3頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月什么是克隆**？克隆的生物范疇分子克?。喝缁蚩寺〖?xì)胞克隆：如雜交瘤細(xì)胞克隆動(dòng)物克?。喊ê艘浦布夹g(shù)（核心）卵裂球培養(yǎng)胚胎分割技術(shù)4第4頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月什么是動(dòng)物克?。縿?dòng)物克隆是一種通過(guò)核移植過(guò)程進(jìn)行無(wú)性繁殖的技術(shù)。基本手段或步驟：1.獲得“供體細(xì)胞的細(xì)胞核”：早期胚胎細(xì)胞、成年體細(xì)胞2.獲得無(wú)核卵母細(xì)胞。3.將目標(biāo)細(xì)胞核經(jīng)顯微手術(shù)移植到去核卵母細(xì)胞中4.適當(dāng)?shù)臈l件下，移植卵母細(xì)胞重新發(fā)育成正常胚胎。5.胚胎被移植到適當(dāng)母體中，獲得與供核個(gè)體遺傳性狀已知的個(gè)體。5第5頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第1節(jié)核移植技術(shù)6第6頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核移植技術(shù)就是利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)細(xì)胞中，或者將兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進(jìn)行交換，從而可能創(chuàng)造無(wú)性雜交生物(新品種)的一項(xiàng)技術(shù)。一、核移植技術(shù)***（Nucleartransfer）概念：7第7頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.核移植技術(shù)的類(lèi)型一、核移植技術(shù)（Nucleartransfer）胚胎細(xì)胞核移植干細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植類(lèi)型8第8頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.核移植技術(shù)的類(lèi)型1.1b胚胎干細(xì)胞核移植

優(yōu)點(diǎn)：91.1a胚胎細(xì)胞核移植優(yōu)點(diǎn)：分化程度低分化潛能大核移植容易成功具有胚胎細(xì)胞上述優(yōu)點(diǎn)體外培養(yǎng)壽命長(zhǎng)，培養(yǎng)更方便第9頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.2體細(xì)胞核移植特點(diǎn)：1.核移植技術(shù)的類(lèi)型10核供體為成體體細(xì)胞范例：克隆綿羊“多莉”體細(xì)胞核全能性的恢復(fù)第10頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.2體細(xì)胞核移植----克隆綿羊“多莉”1.核移植技術(shù)的類(lèi)型11第11頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.2體細(xì)胞核移植----“多莉”的意義1.核移植技術(shù)的類(lèi)型促進(jìn)生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的研究獲得更多的優(yōu)秀動(dòng)物個(gè)體可以復(fù)制生產(chǎn)高價(jià)藥物的動(dòng)物12第12頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月為何是突破性的工作：解決了使供體細(xì)胞與核受體細(xì)胞(去核卵細(xì)胞)同步的方法。解決了用體細(xì)胞做核供體與轉(zhuǎn)基因的問(wèn)題。13第13頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月克隆羊多莉的重要生物學(xué)意義***：第一，它證明了：14一個(gè)已經(jīng)完全分化了的動(dòng)物體細(xì)胞核仍然保持著當(dāng)初胚胎細(xì)胞的全部遺傳信息分化了的體細(xì)胞具有再分化的全能性（可恢復(fù)發(fā)育過(guò)程中失去的全能性）

遺傳物質(zhì)是可逆變化的第14頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二，多莉的成功提示：15在培育體細(xì)胞成為核供體之前，利用“基因靶”技術(shù)精確地植入外源目的基因，誘發(fā)核基因的遺傳改變?cè)儆眠x擇技術(shù)準(zhǔn)確地挑選那些含目的基因的細(xì)胞作為核供體，從而生產(chǎn)出基因克隆體。第15頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三，多莉羊的誕生標(biāo)記：人類(lèi)可以對(duì)基因進(jìn)行有規(guī)律地控制而解決更多的問(wèn)題利用克隆技術(shù)復(fù)制哺乳類(lèi)動(dòng)物的最后技術(shù)障礙已被突破，在理論上已成為可能。16第16頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.2體細(xì)胞核移植----“多莉”的后續(xù)影響1.核移植技術(shù)的類(lèi)型產(chǎn)生克隆人的倫理問(wèn)題促進(jìn)克隆技術(shù)的變革2002年，時(shí)年6歲的多莉因“老齡性”肺部感染而安樂(lè)死，再次引發(fā)克隆動(dòng)物是否“早衰”的爭(zhēng)論17第17頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)的主要操作程序****(1)核受體的處理和制備18(3)細(xì)胞核移植(2)核供體的處理和制備(4)重組核的激活(6)核移植胚胎移入代孕母畜（即胚胎移植）(5)重組胚的體外或體內(nèi)培養(yǎng)第18頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月克隆羊多莉產(chǎn)生的技術(shù)流程19第19頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核受體細(xì)胞選擇：去核卵母細(xì)胞常常作為核移植的受體細(xì)胞。選擇的生物學(xué)依據(jù)(或?yàn)楹芜x擇卵細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞)：(1)

核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備20在卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達(dá)程序發(fā)生重新排列。使已經(jīng)分化了的細(xì)胞重新回到發(fā)育過(guò)程的原點(diǎn)，同受精卵一樣開(kāi)始個(gè)體發(fā)育過(guò)程。第20頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月卵母細(xì)胞的來(lái)源：用激素對(duì)雌體進(jìn)行超排處理，從輸卵管沖出體內(nèi)成熟的MII

卵母細(xì)胞。從屠宰場(chǎng)收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在體外培養(yǎng)成熟后作為受體。冷凍保存的卵母細(xì)胞(1)

核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備21第21頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月卵母細(xì)胞的去核處理：(1)

核受體細(xì)胞的準(zhǔn)備22

將MII卵母細(xì)胞置于含細(xì)胞松弛素(5-7.5ug/mL)的培養(yǎng)液處理10-20min.

顯微鏡下以持卵管吸住卵母細(xì)胞.以尖端去核針刺穿透明帶，吸出第一極體和極體下1/3胞質(zhì).第22頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月供體細(xì)胞核具備的條件：必須是完整的二倍體，保持有供體動(dòng)物完整的基因組供體細(xì)胞核必須能夠在受體細(xì)胞質(zhì)的作用下，產(chǎn)生細(xì)胞分化過(guò)程的逆轉(zhuǎn)，能重新完成從受精到發(fā)育成一個(gè)正常動(dòng)物個(gè)體的全過(guò)程。(2)核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備23第23頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月供體細(xì)胞類(lèi)型：胚胎卵裂球細(xì)胞體細(xì)胞胚胎干細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞(2)核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備24第24頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(3)細(xì)胞核移植胞質(zhì)內(nèi)注射透明帶下注射25胞質(zhì)內(nèi)注射是用一個(gè)外徑5～8μm

的注核針吸取供體核后直接注射進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)把供體細(xì)胞核注射在透明帶與卵母細(xì)胞之間的卵周隙中，核移植后用電刺激進(jìn)行細(xì)胞融合第25頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月固定針對(duì)準(zhǔn)極體部位，將卵母細(xì)胞固定，去核微吸管對(duì)準(zhǔn)極體插入透明帶，將極體和部分細(xì)胞質(zhì)吸入吸管中26第26頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月吸管拉出時(shí)，細(xì)胞膜被拉長(zhǎng)形成一個(gè)橋，吸管脫離透明帶，質(zhì)膜被掐斷，擠推出管中的極體和細(xì)胞質(zhì)27第27頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月體外受精卵形成的8細(xì)胞牛胚胎經(jīng)透明質(zhì)酸處理后，分離出8枚分裂球，吸取細(xì)胞核28第28頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月將胚胎細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞的透明帶中29第29頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(4)激活受精引起的卵母細(xì)胞激活人工的激活激活是胚胎發(fā)育所必需的人工激活:30是通過(guò)電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細(xì)胞從MII期中解放出來(lái)，并轉(zhuǎn)到“受精”的狀態(tài)瞬時(shí)直流電脈沖激活化學(xué)試劑激活：Ca2+載體、乙醇、SrCl2、放線菌酮、離子霉素人工激活的手段:第30頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(5)重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng)核移植胚的體內(nèi)培養(yǎng)：一般植入輸卵管4-7d，發(fā)育到桑椹胚或囊胚，如牛、羊、豬核移植胚的體外培養(yǎng)：體外培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)育到桑椹胚或囊胚，如大鼠、小鼠、兔31第31頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(6)胚胎移植受體母畜的選擇：皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強(qiáng)、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N移植部位：輸卵管、子宮角移植方法：同期發(fā)情處理常規(guī)法移植32第32頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第2節(jié)核移植技術(shù)的應(yīng)用33第33頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、核移植技術(shù)的應(yīng)用1．制備轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，

進(jìn)行生物藥物生產(chǎn)2．培育優(yōu)良畜種，擴(kuò)大良種種群3．開(kāi)展異種動(dòng)物克隆，拯救瀕危動(dòng)物轉(zhuǎn)基因克隆山羊生產(chǎn)：抗凝血因子III轉(zhuǎn)基因克隆羊、牛生產(chǎn)：a-1-抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因克隆牛生產(chǎn)：膠原蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬生產(chǎn)：人生長(zhǎng)激素培育品系更純的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)畜種培育種間雜交動(dòng)物，用于育種用兔卵母細(xì)胞獲得大熊貓?jiān)缙谂咛?4第34頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、核移植技術(shù)的應(yīng)用4．與干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，開(kāi)展治療性克隆治療性克隆***(Therapeuticcloning)利用核移植技術(shù)與轉(zhuǎn)基因和胚胎干細(xì)胞等生物技術(shù)結(jié)合，體外培養(yǎng)所需細(xì)胞、組織器官、以替代或修補(bǔ)患者損傷或患病的細(xì)胞、組織、器官的過(guò)程運(yùn)用舉例：患者體細(xì)胞去核人卵母細(xì)胞重組胚囊胚ES細(xì)胞定向分化多巴胺神經(jīng)元帕金森病胰島細(xì)胞糖尿病肝細(xì)胞肝纖維化CD4+T細(xì)胞艾滋病35第35頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、核移植技術(shù)的應(yīng)用5．利用核移植技術(shù)，研究生物學(xué)的基本問(wèn)題細(xì)胞分化基因調(diào)控核質(zhì)關(guān)系基因組印記36第36頁(yè)，課件共40頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月克隆技術(shù)存在的問(wèn)題理論問(wèn)題分化的體細(xì)胞克隆對(duì)遺傳物質(zhì)重編程的機(jī)理還不清楚

細(xì)胞核內(nèi)關(guān)閉的基因如何重啟表達(dá)細(xì)胞如何重新恢復(fù)全能性及過(guò)程克隆動(dòng)物的連續(xù)后代是否會(huì)累積突變基因克隆動(dòng)物是否會(huì)記住供體細(xì)胞的年齡克隆過(guò)程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問(wèn)題