全面的質(zhì)粒抽提純化疑難解答

/全面的質(zhì)粒抽提純化疑難解答來源:生興生物質(zhì)粒抽提該實驗成功的標(biāo)志是去除RNA,將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組DNＡ分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì),得到相對純凈的質(zhì)粒。圖：質(zhì)粒大量抽提1。常用試劑用途（１）溶液I：葡萄糖/Tris-Cl／EDTＡ，pH8.０。溶霉菌:水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-１，4糖苷鍵，因而具有溶菌作用.葡萄糖：使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部，增加溶液的粘度，防止ＤＮA受機(jī)械剪切力作用而降解。Trｉs-Cl：控制ＰH值。ＥDTA：螯合Ｍg2+、Ca2+等金屬離子,抑制脫氧核酸酶對DNA的降解作用（ＤNasｅ作用時一定的金屬離子作輔基)。有利于溶菌酶的作用,因為溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。(2）溶液II:新鮮ＮａOH/SDＳ.新鮮NaOH：NaOＨ是溶解細(xì)胞的試劑，用新鮮的NaOH是為了保證NaＯH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性.核酸在pＨ值為5~９的溶液中是最穩(wěn)定的，但ｐH大于12或小于３時,就會引起雙鍵之間氫鍵的解離而變性.在溶液Ⅱ中的ＮaOH濃度為0.2Ｎ，加入提取液時,該系統(tǒng)的ｐＨ就會高達(dá)12．6，因而促使染色體DNＡ與質(zhì)粒DNA的變性。SDS:SＤS為陰離子表面活性劑，主要功能有:溶解細(xì)胞膜上的脂肪與蛋白,從而破壞細(xì)胞膜;解聚細(xì)胞中的核蛋白，SDS-蛋白質(zhì)結(jié)合為復(fù)合物,使蛋白變性沉淀下來，但ＳDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取過程中,必須把它去除干凈，以防用RＮase去除ＲNA時受到干擾.（３）溶液III：醋酸鉀（KＡc)緩沖液ＫAc:用pＨ4。8的ＫAc溶液是為了把pＨ12。6的抽取液pH調(diào)回到中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在.而高鹽的３mol∕ＬKAc有利于變性的大分子染色體DNA、ＲNＡ以及SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷。減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SＤS－蛋白質(zhì)復(fù)合物作用后，能形成溶解度較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀完全。（4)苯酚/氯仿／異戊醇：沉淀蛋白質(zhì).酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中,而酚會抑制很多酶反應(yīng)(比如限制性酶切反應(yīng)），因此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除。異戊醇其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。（5）乙醇:沉淀質(zhì)粒DNＡ。此為實驗中最常用的沉淀方法.DＮＡ溶液時以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在的ＤNＡ，當(dāng)加入乙醇時,乙醇會奪去DNＡ周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合.乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。使用乙醇在低溫條件下沉淀ＤNA,分子運動大大減少，DNＡ易于聚合而沉淀，且溫度越低,DNA沉淀得越快。(6)氯霉素：大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來煞為費事，大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來煞為費事,而在對數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等.而在細(xì)菌繁殖的對數(shù)生長期中期加入氯霉素還可以增加質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù),也可以抑制在需要大量制備質(zhì)粒時,細(xì)菌增長過多,便于質(zhì)粒的抽提。２.純化方法常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒ＤNA相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質(zhì)。例如,用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體ＤNA就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DＮA分子的結(jié)合量有所不同.溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與ＤNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DＮA的長度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DＮA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加，從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和（每２個堿基對大約結(jié)合１個溴化乙錠分子）。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)ＤNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。一些大腸桿菌菌株（如ＨB１01的一些變種衍生株）用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類,當(dāng)隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時它們會惹出麻煩.糖類會在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DＮA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒ＤNA內(nèi)污染有糖類,而糖類可抑制多種限制酶的活性。故從諸如HＢ101和ＴG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時，不宜使用煮沸法多年來，氯化銫—溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA的首選方法。然而該過程既昂貴又費時,為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNＡ和宿主DＮＡ的方法。３.疑難問題解答Q:質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割？A：可能是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠，吸入了雜質(zhì)。可以用酚：氯仿對溶液進(jìn)行抽提以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果依然存在，可用離心柱層析注純化DNA.乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分,殘留的鹽類會影響酶切.Q：加入溶液Ⅲ后，細(xì)菌碎片貼壁不緊，不能形成致密沉淀塊？Ａ：由于溶液Ⅲ與細(xì)菌裂解物混合不充分，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘，然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。Q:加入溶液Ⅱ與溶液Ⅲ時，搖動時用力適當(dāng)?Ａ：因為既要使試劑與染色體DNA充分作用使之變性；又要使染色體DＮＡ不斷裂成小片段而能與質(zhì)粒ＤＮA相分離。這就要求試劑與溶菌液充分搖勻，不可過分用力。Q：加入溶液Ｉ蝸旋振蕩時,發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不易混勻,或成細(xì)砂樣。Ａ:很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時間、降低培養(yǎng)溫度,通常降低培養(yǎng)溫度會使細(xì)菌生長更加穩(wěn)定。同時也要注意是否有其他菌污染。Q：加入溶液II，菌液渾濁度沒有發(fā)生明顯變化。Ａ:裂解不完全，主要問題是發(fā)生在溶液ＩI上。確保10％SDS是澄清的，確認(rèn)NaOH是有效的.Q：手工提取質(zhì)粒,使用PEG８0０0純化的問題。A：分子生物學(xué)使用級別ＰEG8000不需要滅菌。加入PＥＧ80００前，質(zhì)粒應(yīng)該溶解在TE中，而不是含有大量其它雜鹽得溶液。用PEG8０0０純化前,質(zhì)粒溶液經(jīng)過乙醇或異丙醇沉淀，且經(jīng)過7０%乙醇漂洗過的。沉淀步驟在冰上或4度進(jìn)行。PEG8000的沉淀是透明的,有時可以看到沉淀，而有時很難辨出沉淀,但后續(xù)酚仿抽提時會在水相和有機(jī)相間出現(xiàn)大量白色沉淀層.Q：沒有提出質(zhì)?；蛘哔|(zhì)粒收獲量很低。A：可能是菌種老化，涂布或者劃線菌種,重新挑選單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。如果是低拷貝質(zhì)粒引起的質(zhì)粒收獲量低，可以采用兩倍的菌體量,并相應(yīng)增加各種Ｂｕffer的用量。可能是洗脫液pH值不正確，將DＮA從柱子上洗脫下來的最適pH值在7.0－8．5之間，如果洗脫液的pH超出此范圍將會顯著影響洗脫效果。Q：加樣時DNA飄出加樣孔外.A:可能是柱中殘留乙醇未除干凈。Q：如何將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組ＤNA分開。A：一是利用酶/弱去污劑部分裂解細(xì)菌，在抽提時只讓質(zhì)粒從細(xì)菌中釋放出來,而不讓基因組DNA從細(xì)菌中出來。二是利用ＮaOH/ＳDＳ完全裂解細(xì)菌，讓質(zhì)粒和細(xì)菌基因組DNA都從細(xì)菌中出來，再利用質(zhì)粒和基因組DNＡ在變性/復(fù)性過程中的不同表現(xiàn)，將質(zhì)粒與基因組ＤＮA分開。Q：菌體的懸浮要徹底Ａ：如果沒有徹底懸浮菌體，則殘留的菌體團(tuán)塊在溶液II加入后,變成一個外圍幾乎徹底裂解，往里不完全裂解，中間沒有裂解的團(tuán)塊。這個團(tuán)塊在溶液III加入后，會有一部分蛋白質(zhì)繼續(xù)存在于溶液中，成為蛋白質(zhì)殘留的最大根源。Ｑ：裂解時間對提取的影響A：加入溶液II后，混勻，體系最好立即變得清澈。體系如果變得清澈了,馬上加入溶液IIＩ中和。如果體系不馬上變清澈，下次少用一點菌液，或者多用一點溶液III。Q：怎樣使蛋白沉淀完全。A：在1。５ml離心管中加入溶液III后,先顛倒兩次,使管底朝上,用指頭彈擊管底數(shù)次，再顛倒混勻。效果非常好.Q：怎樣降低基因組ＤNA殘留？Ａ:操作過程中要盡可能不打斷基因組DNA。裂解體系越粘稠,基因組DＮＡ越容易被扯斷；操作手法越重，基因組DNA也越容易被打斷。溫和操作，使用相對過剩的試劑，是降低基因組DNA殘留的最好方法。Q：如何降低變性超螺旋?A:用堿裂解法抽提質(zhì)粒，變性超螺旋的出現(xiàn)是不可避免的，因此抽提時可使用相對過剩的溶液，在加入溶液II后,體系能在1分鐘內(nèi)變澄清,再快速加入溶液IIＩ，這樣基本上能將變性超螺旋的出現(xiàn)控制在電泳看不見的水平。Ｑ：從有些宿主菌中抽提質(zhì)粒