蘭州大學酶促反應動力學

第九章酶促反應動力學一、化學動力學基礎二、底物濃度對酶反應速率的影響三、酶的抑制作用四、溫度對酶反應速度的影響五、pH對酶反應的影響六、激活劑對酶反應的影響目前一頁\總數五十四頁\編于十七點一、化學動力學基礎化學反應的兩個基本問題：（1）反應進行的方向、可能性和限度；（2）反應進行的速率和反應機制。（一）反應速率及其測定反應速率是以單位時間內反應物或生成物濃度的改變來表示。用瞬時速率表示反應速率：

v=dc/dt反應速率的測定實際上就是測定不同時間的反應物或生成物的濃度。目前二頁\總數五十四頁\編于十七點（二）反應分子數和反應級數1.反應分子數：在反應中真正相互作用的分子的數目。單分子反應，雙分子反應，……判斷一個反應是單分子反應還是雙分子反應，應先了解反應機制，即反應過程中各個單元反應是如何進行的。2.反應級數：根據實驗結果，整個化學反應的速率服從哪種分子反應速率方程式，則這個反應即為幾級反應。一級反應，二級反應，……，零級反應。目前三頁\總數五十四頁\編于十七點（三）各級反應的特征1.一級反應凡是反應速率只與反應物的濃度的一次方成正比的，這種反應就稱為一級反應。速率常數與半衰期成反比，半衰期與反應物的初濃度無關。2.二級反應凡是反應速率與反應物濃度二次方（或兩種物質濃度的乘積）成正比的，這種反應就稱為二級反應。半衰期與初濃度成反比。3.零級反應凡是反應速率與反應物濃度無關而受它種因素影響而改變的反應。半衰期與初始濃度成正比。目前四頁\總數五十四頁\編于十七點二、底物濃度對酶反應速率的影響（一）中間絡合物學說1903年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的實驗在低底物濃度時,反應速度與底物濃度成正比，表現為一級反應特征。當底物濃度達到一定值，反應速度達到最大值（Vmax），此時再增加底物濃度，反應速度不再增加，表現為零級反應。目前五頁\總數五十四頁\編于十七點酶與底物的中間絡合物學說（Henri和Wurtz）

S+EESP+E中間產物假說證據：（1）ES復合物已被電子顯微鏡和X射線晶體結構分析直接觀察到。（2）酶和底物的光譜特性在形成ES后發(fā)生變化。（3）酶的物理性質經常在形成ES后發(fā)生變化。（4）已分離得到ES復合物。（5）平衡透析時，底物濃度在半透膜內外不等。目前六頁\總數五十四頁\編于十七點（二）酶促反應的動力學方程式1.米氏方程式的推導推導原則：從酶被底物飽和的現象出發(fā)，按照“穩(wěn)態(tài)平衡”假說的設想進行推導。米氏方程:米氏常數:目前七頁\總數五十四頁\編于十七點米氏方程的推導令：將（4）代入（3），則：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：則：(1)經整理得：由于酶促反應速度由[ES]決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當酶反應體系處于恒態(tài)時：當[E]=[ES]時，(4)所以

目前八頁\總數五十四頁\編于十七點酶反應速度與底物濃度的關系曲線當[S]<<Km時當[S]＞＞Km時當[S]=Km時目前九頁\總數五十四頁\編于十七點2.動力學參數的意義（1）米氏常數的意義a.不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個重要的特征物理常數,只與酶的性質有關，而與其濃度無關。b.Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。c.Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。（同一種酶有幾種底物就有幾個Km值，其中Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物）一般情況下，1/Km可以近似地表示酶對底物的親和力大小，1/Km愈大，表明親和力愈大。目前十頁\總數五十四頁\編于十七點所以1/Km表示形成ES的趨勢大小特例：Km=K2/K1=Ks(在K3K1，K2時)d.Km與Ks

Km不等于Ks。在K3<<K1、K2時，Km看作Ks，也只有此時1/Km才可以近似表示酶與底物結合的難易程度。

e.Km與Km無抑制劑時，ES的分解速度與形成速度的比值符合米氏方程，為Km;而有抑制劑時發(fā)生變化，則不符合米氏方程，為Km。目前十一頁\總數五十四頁\編于十七點f.Km和米氏方程的實際應用若已知某個酶的Km值，可以計算在某一個底物濃度時，反應速度相當于最大反應速度的百分率。g.Km可以幫助推斷某一反應的方向和途徑目前十二頁\總數五十四頁\編于十七點（2）Vmax和k3(kcat)的意義在一定的酶濃度下，Vmax是一個常數，它只與底物的種類及反應條件有關。當[S]很大時，Vmax=K3[E]K3代表酶被底物飽和時每秒鐘每個酶分子轉換底物的分子數，稱為轉換數（或催化常數，Kcat），表明酶的最大催化效率。轉換數的倒數即為催化周期：一個酶分子每催化一個底物分子所需的時間。乳糖脫氫酶轉換數為1000/秒，則它的催化周期為10-3秒目前十三頁\總數五十四頁\編于十七點（3）Kcat/Km的意義在生理條件下，[S]/Km=0.01～1.0[S]<<Km時：Kcat/Km的上限是K1，即生成ES復合物的速度(酶促反應的速度不會超過ES的形成速度K1，在水相中不會超過108～109）目前十四頁\總數五十四頁\編于十七點只有Kcat/Km可以客觀地比較不同的酶或同一種酶催化不同底物的催化效率目前十五頁\總數五十四頁\編于十七點3.利用作圖法測定Km和Vmax值（1）

Lineweaver-Burk

雙倒數作圖法米氏方程的雙倒數形式：基本原則：將米氏方程變化成相當于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。1Km11—=——.—+——

vVmax

[S]Vmax

目前十六頁\總數五十四頁\編于十七點（2）Eadie-Hofstee作圖法v～v/[S]作圖法v=Vmax－Km·——v[S]v[S]vVmax-Km目前十七頁\總數五十四頁\編于十七點（3）Hanes-Woolf作圖法——＝——＋——[S][S]vVmaxVmaxKm1Km11—=——.—+——

vVmax

[S]Vmax

在兩邊均乘以[S]：以～[S]作圖[S]v-Km[S]v[S]Vmax1目前十八頁\總數五十四頁\編于十七點（4）Eisenthal作圖法目前十九頁\總數五十四頁\編于十七點（三）多底物的酶促反應1.多底物酶促反應按動力學機制分類①有序反應只有Leadingsubstrate(領先底物A)首先與酶結合，然后B才能與酶結合，形成的三元復合物EAB（ternarycomplex)轉變?yōu)镋PQ，B的產物P先釋放，A的產物Q后釋放?！镌谌鄙貯時，B不能與E結合E+A+B→AEB→PEQ→E+P+Q（1）序列反應目前二十頁\總數五十四頁\編于十七點E→AE→AEB→QEP→QE→EABPQPEAAEAEBQEPBQEQA與其產物Q相互競爭地結合E，但A和B互不竟爭反應的總方向決定于A、Q的濃度和反應的平衡常數目前二十一頁\總數五十四頁\編于十七點NAD＋與NADH相互競爭E上的NAD＋結合部位目前二十二頁\總數五十四頁\編于十七點②隨機反應底物A、B與酶結合的順序是隨機的，形成的三元復合物AEB→QEP，產物P、Q的釋放順序也是隨機的。限速步驟是AEB→QEPA與Q相互競爭E上的底物結合部位A，B與P相互競爭E上的底物結合部位B反應的總方向決定于A、B、Q、P的濃度和反應的平衡常數目前二十三頁\總數五十四頁\編于十七點（2）乒乓反應底物A先與E結合成AE二元復合物，AE→PF（修飾酶形式），釋放第一個產物P，接著底物B與F形成FB，FB→EQ，釋放第二個產物Q。A與Q競爭自由酶形式E，B與P競爭修飾酶形式F。整個反應歷程中只有二元復合物形式，沒有三元復合物形式。目前二十四頁\總數五十四頁\編于十七點2.雙底物反應的動力學方程（1）乒乓機制的動力學方程KmA：[B]達到飽和濃度時A的米氏常數KmA′：A的表觀米氏常數Vmax：[A][B]都達到飽和濃度時的最大反應速度目前二十五頁\總數五十四頁\編于十七點★乒乓機制的動力學曲線是兩組平行直線★表觀米氏常數KmA′（KmB′）隨[B]（[A]）濃度的增大而增大★表觀最大反應速度Vmax′隨[B]（[A]）的增大而增大目前二十六頁\總數五十四頁\編于十七點（2）序列機制的底物動力學方程目前二十七頁\總數五十四頁\編于十七點★序列機制的動力學曲線是兩組相交直線（交于X軸負側）★交點在X軸：表觀KmA′（KmB′）不隨[[B]（[A]）濃度變化而變化（KmA′=KmA、KmB′=KmB）★交點在X軸上：表觀KmA′（KmB′）隨[[B]（[A]）濃度的增加而減小★交點在X軸下：表觀KmA′（KmB′）隨[[B]（[A]）濃度的增加而增大★表觀最大反應速度Vmax′隨[B]（[A]）的增大而增大目前二十八頁\總數五十四頁\編于十七點三、酶的抑制作用變性作用(denaturation)：抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或喪失但并不引起酶蛋白變性變性劑沒有選擇性抑制劑有不同程度的選擇性研究抑制劑對酶的作用有重大的意義：（1）藥物作用機理和抑制劑型藥物的設計與開發(fā)（2）了解生物體的代謝途徑，進行人為調控或代謝控制發(fā)酵（3）通過抑制劑試驗研究酶活性中心的構象及其化學功能基團，不僅可以設計藥物，而且也是酶工程和化學修飾酶、酶工業(yè)的基礎目前二十九頁\總數五十四頁\編于十七點（一）抑制程度的兩種表示方法1、相對活力★相對活力分數★相對活力百分數2、抑制率★抑制分數★抑制百分數目前三十頁\總數五十四頁\編于十七點（二）抑制作用的類型1、不可逆的抑制作用抑制劑與酶活性中心（外）的必需基團共價結合，使酶的活性下降，無法用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復活。2、可逆的抑制作用

抑制劑與酶蛋白非共價鍵結合，可以用透折、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復活。目前三十一頁\總數五十四頁\編于十七點（1）競爭性抑制（Competitiveinhibition）

抑制劑具有與底物類似的結構，競爭酶的活性中心，并與酶形成可逆的EI復合物，阻止底物與酶結合?？梢酝ㄟ^增加底物濃度而解除此種抑制。目前三十二頁\總數五十四頁\編于十七點（2）非競爭性抑制（noncompetitiveinhibition）底物和抑制劑可以同時與酶結合，但是，中間的三元復合物ESI不能進一步分解為產物，因此，酶的活性降低。抑制劑與酶活性中心以外的基團結合，其結構可能與底物無關。不能通過增加底物濃度的辦法來消除非競爭性抑制作用。目前三十三頁\總數五十四頁\編于十七點（3）反競爭性抑制酶只有在與底物結合后，才能與抑制劑結合。E+S→ES+I→ESI≠P常見于多底物的酶促反應中目前三十四頁\總數五十四頁\編于十七點（三）可逆抑制作用與不可逆抑制作用的鑒別1、通過透析、超濾、凝膠過濾等2、通過v-E速度曲線[E]v123(1)反應體系中不加I。(2)反應體系中加入一定量的不可逆抑制劑。(3)反應體系中加入一定量的可逆抑制劑。目前三十五頁\總數五十四頁\編于十七點[E]v不可逆抑制劑的作用[E]v可逆抑制劑的作用[I]增高→[I]增高3、通過可逆抑制劑的動力學曲線可以區(qū)分三種可逆抑制作用目前三十六頁\總數五十四頁\編于十七點（四）可逆抑制作用動力學1、競爭性抑制動力學方程：（Ki為EI的解離常數）★Vmax不變;Km變大，而且隨[I]濃度的增大而增大。目前三十七頁\總數五十四頁\編于十七點2、非競爭性抑制動力學方程：★Km不變，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）目前三十八頁\總數五十四頁\編于十七點3、反競爭性抑制動力學方程：★Km及Vmax都變小目前三十九頁\總數五十四頁\編于十七點可逆抑制的動力學比較抑制類型Vmax變化Km變化無抑制劑//競爭性抑制作用不變變大非競爭性抑制作用變小不變

反競爭性抑制作用變小變小目前四十頁\總數五十四頁\編于十七點（五）一些重要的抑制劑1、不可逆抑制劑：（1）非專一性不可逆抑制劑

與酶的活性中心以及活性中心外的某一類或幾類必需基團反應①有機磷的?；锒惐柞７―FP，神經毒氣）和許多有機磷農藥。抑制機理：與蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷脂鍵。毒理：強烈抑制乙酰膽堿脂酶（神經毒劑）。

解毒劑：PAM（解磷定）可以把酶上的磷酰基團除去。目前四十一頁\總數五十四頁\編于十七點②有機汞、有機砷化合物抑制機理：使酶的巰基烷化毒理：主要與還原型硫辛酸輔酶反應，抑制丙酮酸氧化酶系統(tǒng)。解毒劑：二巰基丙醇（BAL）、Cys、GSH等過量的巰基化合物。目前四十二頁\總數五十四頁\編于十七點③重金屬Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多數酶失活，EDTA可解除。④、烷化物★含鹵素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、鹵乙酰苯等）常用于鑒定酶中巰基。⑤氰化物、硫化物、CO與含鐵卟啉的酶中的Fe2+結合，阻抑細胞呼吸目前四十三頁\總數五十四頁\編于十七點⑥青霉素不可逆抑制糖肽轉肽酶⑦還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等巰基試劑還原酶的二硫鍵、含活潑雙鍵試劑（與—ＳＨ、—ＮＨ２反應）Ｎ—乙基順丁烯二酰亞胺

⑧親電試劑四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。

目前四十四頁\總數五十四頁\編于十七點（2）專一性不可逆抑制劑此類抑制劑僅僅和某一種酶的活性部位的必需基團反應。①Ks型不可逆抑制劑（親和標記試劑，親和修飾試劑）具有與底物相似的結構，同時還帶有一個能與酶活性中心或活性中心外的必需基團進行化學反應的活潑基團。專一性程度取決于它與活性中心及活性中心外的的Ks之比。胰乳蛋白酶的最佳底物：對-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯Ks型不可逆抑制劑：對－甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）-CH2-Cl與酶活性部位的一個His-咪唑基距離很近，很易使之烷基化。目前四十五頁\總數五十四頁\編于十七點②Kcat型不可逆抑制劑（自殺性底物）具有與底物相似的結構，不僅能與酶結合，而且潛伏的反應基團（latentreactivegroup）能被酶催化而活化，并與酶活性中心必需基團進行不可逆結合。

目前四十六頁\總數五十四頁\編于十七點2、可逆抑制劑★競爭性抑制劑

許多代謝類似物都是競爭性抑制劑，可用作抗菌藥和抗癌藥物。★磺胺類藥物及其作用機理對氨基苯磺酰胺或其衍生物對氨基苯甲酸的結構類似物，競爭性抑制細菌的二氫葉酸合成酶活性目前四十七頁\總數五十四頁\編于十七點★抑制劑與藥物開發(fā)Kcat型不可逆抑制劑的專一性程度很強，前景廣闊底物類似物型的競爭性抑制劑最易開發(fā)過度態(tài)底物類似物型藥物最具價值(高效\特異)目前四十八頁\總數五十四頁\編于十七點四、溫度對酶促反應速度的影響（一）最適溫度及影響因素

溫度對酶促反應速度的影響有兩個方面：①提高溫度，加快反應速度。②提高溫度，酶變性失活。

溫度系數Q10：溫度升高10℃，反應速度與原來的反應速度之比，大多數酶的Q10一般為1～2。溫血動物的酶，最適溫度35℃～40℃，植物酶最適溫度40℃～50℃，細菌TaqDNA聚合酶70℃。最適溫度不是酶的特征常數，它與底物種類、